升降散对脓毒症大鼠心肌损伤保护的实验研究

沈 芸 胡冠宇 郭 健 钱风华 赵 雷 沈梦雯 丁纯蕾 钱义明

（上海中医药大学岳阳临床医学院，上海 201203）

脓毒症即宿主对感染的反应失调而致的危及生命的器官功能障碍，也就是说当机体对感染的反应损伤了自身组织和器官进而危及生命就称为脓毒症。新定义下的Sepsis 3.0强调了多器官功能衰竭，病情进展则危急甚至威胁到生命，比前两个版本的定义更加适用于临床诊断［1］。因其患病率和死亡率高，是急诊及ICU重症医学研究方向的关注点［2］。心脏为机体的最重要的器官，是全身供血的能源泵，也是脓毒症发生时最易受损的器官［3］。脓毒症心肌功能障碍（SMD）发生率为64%，通常表现为心脏心室扩张、心肌收缩能力下降以及射血功能减退等［4］。尽管脓毒症心肌损伤具有潜在可逆性特点，其病死率仍高于50%，使医学界面临巨大困难以及挑战［5］。脓毒症在中医学中属“温病”“瘟疫”“热毒”范畴。本课题组既往临床实践和基础研究已证实升降散能改善脓毒症患者临床症状，降低脓毒症大鼠炎症指标，具有心脏保护作用。本研究旨在研究不同浓度的升降散对心肌细胞的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体（SPF）级远交群（SD）雄性大鼠104只，体质量200～150 g。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK （沪）2012-0003。动物合格证号：2015000535015。标准条件下饲养大鼠，自由摄食饮水，1周后，适应正常的大鼠纳入本次实验中。

1.2 试药及仪器 本实验中药采用升降散冻干粉，升降散干冻粉为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院制作。制作具体步骤为：1）将升降散的4种组成药物僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄按 2∶2∶1∶4 比例加 2000 mL 水武火先煎2 h，再次加水熬制2 h。2）文火煎煮浓缩至200 mL，用5层纱布过滤，收集提取液，将提取液干燥处理。3）以冻干粉形式保存，为后期使用做准备。Trizol（1596-026）购自 Invitrogen、DEPC 处理水（R1600）购自基尔顿生物，异丙醇（80109218）、无水乙醇（100092680）、氯仿（10023419）购自国药集团；Elisa试剂盒：上海源叶生物科技有限公司。

1.3 分组与造模 按照随机数字表法随机将104只大鼠进行分组。正常组（n=8），脓毒症模型组（n=24），升降散低剂量组（1.0 g/kg）（n=24），升降散中剂量组（2.0 g/kg）（n=24），升降散高剂量组（3.0 g/kg）（n=24）。脓毒症模型组、升降散低剂量组、升降散中剂量组、升降散高剂量组又分为24、48、72 h 3个时间节点亚组，每个亚组大鼠均为8只。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备脓毒症模型。大鼠以20 g/L戊巴比妥钠麻醉后沿腹正中线作1.5 cm长的切口，在盲肠根部结扎盲肠。用10 mL注射器针头在盲肠结扎远端穿通2次形成盲肠漏。随后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。术毕，立即予0.9%氯化钠注射液1 mL腹腔注射抗休克［6］。

1.4 给药方法 升降散低、中、高剂量组于造模前72 h及造模后6 h予相应的升降散灌胃。正常组、模型组于术前72 h及术后6 h给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.5 标本采集及检测 1）大鼠血清标本采集：按造模后24、48、72 h时间节点，先以2%苯巴比妥50 mg/kg的剂量经腹腔注射麻醉大鼠，经大鼠腹主动脉处采血约10 mL左右，用台式离心机3000 r/min离心，离心15 min之后，取离心上清液，在-20℃的条件下贮存待用。采用ELISA法检测大鼠血清肌钙蛋白（cTnI）、脑钠肽（BNP）水平。2）心脏组织标本的采集和心肌匀浆制备：按24、48、72 h时间节点，血清标本采集后，沿腹腔手术切口向上剪开胸腔，迅速取出心脏，随即分离大鼠左心室心肌，用4℃的低温氯化钠溶液进行清洗，洗净后于左心室采取心肌组织，在4℃的条件下用4%的多聚甲醛（pH=7.4）进行固定，固定后用光镜观察心肌形态，记录心肌形态改变。3）死亡率观察：大鼠造模后，按时间节点依次观察大鼠是否存活。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。若实验数据符合方差齐性，则采用单因素方差分析及用LSD法进行多重比较各组间的差异；若实验数据方差齐性不符合，则采用Kruskal-Wallis非参数检验及LSD法进行多重比较各组间的差异。Pearson相关分析两变量之间的直线相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠病死率 见表1。模型组48、72 h病死率均为12.50%；升降散低剂量组大鼠24、48、72 h病死率分别为12.50%；升降散中剂量组大鼠48 h病死率为12.50%；升降散高剂量组大鼠48 h病死率为12.50%，各组间差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠不同时间段病死率［n（%）］

2.2 光镜观察心肌细胞超微结构 见图1。造模后，与空白组比较，模型组大鼠24、48、72 h光镜下见心肌细胞变性肿大，各细胞间排列疏松，心肌间质组织水肿，心肌肌浆浓缩；升降散高剂量组治疗后各时间节点，大鼠心肌细胞上述情况较模型组有不同程度的缓解。

图1 光镜观察心肌细胞超微结构（HE染色，100倍）

2.3 大鼠血清cTnI和BNP水平比较 见表2～表3。模型组大鼠造模后血清BNP逐渐升高，72 h达高峰，与空白组比较，24、48、72 h差异有统计学意义（P<0.001）；与模型组比较，升降散低剂量组48、72 h差异有统计学意义（P<0.05）；升降散中剂量组 24、48、72 h差异有统计学意义（P<0.05）；升降散高剂量组24、48、72 h差异有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠造模后血清 cTnI逐渐升高，72 h 达高峰，24、48、72 h 差异有统计学意义（P<0.001）。与模型组相比较，升降散低剂量组48、72 h差异有统计学意义（P<0.05）；升降散中剂量组 24、48、72 h 差异有统计学意义（P<0.05）；升降散高剂量组 24、48、72 h差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 各组大鼠BNP水平比较（μg/L，x±s）

表3 各组大鼠cTnI变化比较（ng/L，x±s）

3 讨 论

升降散初见于明代龚廷贤《万病回春·瘟疫门》，后收录于《伤暑全书》，本方以僵蚕为君，蝉蜕为臣，姜黄为佐，大黄为使，具有解郁宣透，降火泄热之功，多用于“表里三焦大热”的温热火郁证，以三焦火郁、气机失畅为病机特点［7］。僵蚕对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等有一定抑制作用；蝉蜕有解热、抗过敏作用［8］；姜黄有抗炎、抗血凝和抗血小板聚集及保护心肌的作用［9-10］。 《素问·六节脏论》说“心者，生之本，神之变也，其华在面，其充在血脉”。中医学认为机体是一个整体，人体自身具有完整性且与自然、社会环境具有统一性。构成人体的各个部分、脏腑、官窍在结构上不可分割，在功能上相互协调，相互为用，在病理上相互影响，疾病相互传变。《内经·素问》曰“心者，君主之官也，神明出焉……主不调则十二官危，凡此十二官者，不得相失也”，是指心脏为君主之官，十二个器官之最大，主宰全身，主宰着人的精神意识思维活动，君主如果不能调畅神智，那么包括心脏在内的十二脏器均将发生危险。这也充分体现了中医学的整体观念学说。由此思考，脓毒症后期，常会发生多脏腑功能衰竭，无论是否心脏最早出现问题，但最终都会被累及，引发多脏腑功能衰竭，即西医学中所说多器官功能障碍综合征（MODS）。这与中医学基础理论完全相吻合。

脓毒症心肌损伤发病机制并不是病原微生物直接侵犯心脏所致，而是与心肌抑制性炎症因子和一氧化氮等有关，是在全身炎症反应综合（SIRS）的基础上发生和演变而来的［11］。脓毒症发生时，机体产生大量炎症因子（如 TNF-α、IL-6），形成级联瀑布效应，从而对心肌造成损伤，心功能障碍，心肌收缩功能下降［12］。目前脓毒症所致心肌功能障碍的机制还并不明确。临床上，cTnI具有快速、诊断窗口期宽等优点，已取代磷酸肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）成为判断心肌损伤的“金标准”［13］，BNP是一种多肽类神经内分泌激素，是临床诊断心力衰竭的定量标志物，不仅反映左室收缩功能障碍，也反映左室舒张功能障碍、瓣膜功能障碍和右室功能障碍情况［14］。cTnI和BNP不仅可以作为诊断脓毒症心肌损伤和心肌功能障碍的指标，也可以作为脓毒症患者病情严重程度和预后的指标［15-16］。因此，本实验选择cTnI和BNP为心功能改善的评价标准。

本研究结果显示，造模后模型组大鼠血清BNP逐渐上升，72 h达到高峰，说明大鼠脓毒症心肌损害的程度随时间的增加而逐渐加重。予不同剂量的升降散治疗后大鼠血清BNP显示出不同程度的降低，与模型组的BNP表达相比较，升降散各组指标下降明显，且随着升降散的浓度升高，大鼠血清BNP下降的程度越明显；同样cTnI与血清BNP呈现相同的趋势，升降散灌胃治疗后的各组大鼠cTnI下降明显，且随着升降散的浓度升高，大鼠血清cTnI下降的程度越明显。虽然升降散高剂量组cTnI、BNP指标下降比升降散中剂量组更多，但差异并不明显。这可能与最优药物浓度相关，还有待进一步研究。

综上所述，升降散可以降低心肌损害功能障碍的指标，对脓毒症大鼠心肌具有保护作用，且升降散浓度越高，心肌保护作用更加明显，随着浓度递增，有疗效递进的相关性。但在临床上运用，不仅要考虑到药物的安全用量限制，还要顾及患者用药的耐受性。本实验为下一步临床疗效再评估做了部分前期工作，还需要我们进一步探究与证实。