超高压液相色谱-质谱同时测定酿酒、制曲原料中多种真菌毒素的方法研究

罗文业，卓毓崇，周 艳，徐克赞，何世兴，时 源，陈 振，徐 源

（四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺646523）

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。许多农作物都很容易被霉菌和真菌侵蚀。植物生长期的胁迫或收获后恶劣的储藏条件都可能使真菌类感染大量日常用品，经常产生无法忍受的味道。也有可能在一些真菌生长过程产生有毒的二级代谢产物，潜在地污染动物饲料和人类消费的食品。这些二级代谢产物一般来说是霉菌毒素。

黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮均属于真菌毒素，在很多国家都对其立法规定了限量。

目前关于粮食中真菌毒素的检测方法有很多，最普遍的是高效液相色谱、紫外检测法、液相色谱-串联质谱法等。但都是一次测定一种真菌毒素，处理也相对复杂。采用超高压液相色谱-质谱同时测定粮食中多种真菌毒素，该方法快速简便,定性、定量准确,灵敏度极高，可以满足国家标准GB 2761—2017对粮食中真菌毒素限量限制的要求。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

小麦、高粱、大米、玉米，市售。乙腈，色谱纯。甲酸，色谱纯。甲醇，色谱纯。正己烷，色谱纯。氯化钠，分析纯。60%甲醇水溶液：量取60 mL甲醇用超纯水定容至100 mL。真菌毒素标准品或标准品溶液：黄曲霉素B1、脱氧雪腐镰刀菌稀醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉素A，有国家认可的标准物质证书，固体标准物质纯度含量≥98.0%。

1.2 实验仪器

超高压液相色谱-质谱联用仪，超高压液相色谱：WATERS ACQUITY UP-LC/TQD,电喷雾（ESI）离子源。色谱柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）或相当者。萃取柱：OASIS HLB 1cc（30 mg）Cartridge，或性能相当者。Masslynx 4.1质谱色谱操作软件。

1.3 仪器工作条件

（1）液相色谱参考条件

色谱柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）或相当者。流动相A：超纯水+0.1%甲酸。流动相B：乙腈+0.1%甲酸。流速：0.3 mL/min。进样体积：10 μL。进样方式：自动进样。柱箱温度：40℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）。检测方式：多反应监测MRM模式。毛细管电压：4 kV。锥孔电压：多级。离子源温度：120℃。脱溶剂气（N2）流量：800 L/h。脱溶剂气（N2）温度：450 ℃。锥孔气（N2）流量：5 L/h。碰撞气体（Ar）压力，3.5×10-3毫巴。质谱参数见表2，其中“*”表示定量离子对。

1.4 真菌毒素标准溶液配制

0.1 mg/mL真菌毒素标准储备溶液：准确称取或吸取一定量上述4种标准品，用甲醇分别配制成0.1 mg/mL标准储备溶液，-18℃下避光保存备用。

标准工作溶液：吸取一定量上述标准溶液于容量瓶中，用甲醇配制成一系列的标准工作溶液。

1.5 试验方法

1.5.1 样品的预处理

将粮食去除杂质后进行粉碎过10目筛，称取样品20 g，加入5 g氯化钠和30 mL正己烷。准确加入100 mL 60%（v/v)甲醇水溶液，摇匀,然后用超声波提取30 min。提取后，用直径15 cm快速定性滤纸过滤。待静置分层后，取1 mL甲醇水溶液用于净化。

1.5.2 样品的净化

分别取1 mL甲醇和水对萃取柱进行活化和平衡，然后往萃取柱中加入1 mL待净化液，当完全通过柱子后加1 mL水进行清洗。清洗结束后加1 mL甲醇进行洗脱，接收洗脱液，用甲醇将洗脱液定容至2 mL，作为测定液待分析。

1.5.3 样品的分析

将净化后的样品放入进样盘中，按照标准曲线绘制时的液相色谱-质谱联用条件自动进样测定。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

流量对LC/MS有重要影响，实验比较了Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和BEH C18（2.1 mm×50 mm 1.7 μm）以及YMC-Pack ODS-AQ(4.6 mm×150 mm,3 μm)色谱柱对4种真菌毒素的分离情况，在相同流速下Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)分离效果好，所以选择其为本实验用分析柱。但不足的是玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A不能分离。

表2 质谱参数

2.1.2 流动相的优化

由于真菌毒素易溶于乙腈，本实验采用乙腈为洗脱剂。为了促进样品的离子化，本实验先后在流动相中加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸铵，结果表明，加入甲酸时的离子丰度最强，因此最终确定在流动相中添加0.1%甲酸进行梯度洗脱。标准溶液色谱图见图1。

图1 4种真菌毒素质谱图

2.2 质谱条件的优化

根据4种真菌毒素的性质和样品的特性，本实验采用电喷雾离子源进行离子化。实验中分别采用正、负两种离子模式，发现正离子模式下的离子化效果明显高于负离子模式。分别在全扫描模式和子离子扫描模式确定了4种真菌毒的质谱参数，结果见表2。

2.3 样品净化条件的选择

对于真菌毒素的萃取和净化，目前相关文献大部分使用乙腈水溶液或甲醇水溶液萃取，用免疫亲和柱和多功能净化柱净化。本实验通过试验采用正己烷配合甲醇水溶液萃取，使用OASIS HLB 1cc（30 mg）Cartridge萃取小柱净化。

2.4 标准曲线和检测限

测定1.4节中的混合标准溶液，绘制标准工作曲线。按照确定的液相色谱-质谱联用条件，待仪器处于稳定状态后，按浓度由低到高的顺序进样检测分析，以真菌毒素的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到4种真菌毒素的线性方程和相关系数。计算3倍信噪比和10倍信噪比时所对应的样品浓度，分别作为方法的检出限和定量限。结果见表3。

表3 线性方程、线性范围及检出限

2.5 方法精密度和加标回收试验

将每种样品连续重复进样5次，测得各组分的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD），来衡量方法的精密度。同时将每种样品取3份，分别添加不同体积的标准溶液，按照1.5节进行前处理，在1.3节条件下测定，计算样品加标回收率。玉米样品的回收实验结果见表4，其他几种粮食样品的回收率也都在80%～96%，各项数据说明该方法的精密度和回收率都比较良好；精密度分析结果见表5，RSD值均小于5%。

表4 玉米样品加标回收率

表5 精密度分析结果

3 结论

本实验建立的超高压液相色谱-质谱法同时检测粮食中黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮4种真菌毒素，采用梯度洗脱，在质谱正离子扫描模式下监测，5 min内完成4个组分检测。4种真菌毒素黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的检出限分别为 0.02 μg/kg、10 μg/kg、0.5 μg/kg、0.4 μg/kg，能满足我国国标GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》对粮食中4种真菌毒素的要求。该方法灵敏度高、准确性好，而且简单快速，能在短时间内检测大量的样品，可用于粮食中真菌毒素的检测及其风险评估。