810 nm半导体激光对豚鼠糖皮质激素依赖性皮炎的作用研究

马 琼，段静娴，王 燕，孙素姣，陈丽华

(大理大学临床医学院医学美容学教研室，云南 大理 671000)

因糖皮质激素外用制剂及含激素类化妆品的滥用，临床上糖皮质激素依赖性皮炎(下称激素依赖性皮炎，corticosteroid addictive dermatitis，CAD)的发病率日益增多。以往的治疗方法仅仅能在一定程度上缓解患者的主观症状或客观症状[1-2]，本研究采用低能量810 nm半导体激光治疗激素依赖性皮炎，探索一种新的既能缓解患者的主观症状，又能改善患者客观症状的安全有效的方法。现报告如下。

1 材料与方法

1.1研究对象：选择健康雄性豚鼠40只(大理大学实验动物中心提供，滇实验动物证第2016102号)，体重(200±50)g，随机分为两组，分别为模型组30只及空白对照组10只。分组饲养：对照组10只一笼、模型组30只分为10只、10只、10只三笼饲养。喂食标准兔饲料(大理大学实验动物中心提供)，并定期补充Vit C预防足部溃疡。所有动物自由摄食、摄水。

1.2制作激素依赖性皮炎豚鼠模型：参考潘炜华等[3]的豚鼠激素依赖性皮炎的动物模型制作方法，两组实验豚鼠采用自身对照法，以背部中线为界，所有实验豚鼠用市售脱毛膏脱去约6 cm×6 cm皮肤作为实验区，对照组左右两侧皮肤、模型组左侧皮肤为对照区，模型组豚鼠右侧皮肤脱毛后涂擦0.05%氯倍他索乳膏(昆明滇红药业有限公司)，2次/d，共涂药60 d制造激素依赖性皮炎皮肤模型。

1.3810 nm半导体激光照射：造模成功后1周，将模型组豚鼠随机分为模型组10只、试验A组10只、试验B组10只。每次激光照射前试验组豚鼠对实验区进行脱毛并固定体位拍照。通过预实验测试光斑，确定激光的照射参数为：双脉冲，能量密度8 J/cm2，脉宽为3 ms，脉冲延时为150 ms，治疗频率1 Hz，光斑直径12 mm，冷却头16 mm×20 mm，每个部位可重复照射两次。激光照射前先由两名实验人员固定豚鼠的四肢及头部，充分暴露照光区皮肤，在治疗区皮肤表面均匀的涂敷医用冷凝胶，厚度大约为1 mm，然后使用上述参数做光斑测试。先观察测试光斑的反应，治疗时将治疗头垂直轻压在凝胶上，对准皮肤，然后逐渐平行移动治疗头开始激光照射。试验A组和试验B组豚鼠采用相同的治疗参数照射右侧皮损区皮肤，试验A组每周照射1次，试验B组 2周照射1次，共进行三次激光照射。

1.4取材：分别于造模成功后一周模型组豚鼠(10只)切取皮肤样本，固定液固定；试验组A豚鼠(10只)于激光照射结束后一周切取皮肤样本，固定液固定；试验B组(10只)及对照组(10只)于激光照射结束后一周切取皮肤样本，固定液固定。取材方法：脱毛后由实验人员固定豚鼠以相对固定的体位拍照，5 ml无菌注射器抽取4%水合氯醛(大理大学第一附属医院制剂室配制)进行腹腔内注射麻醉，先用75%乙醇消毒背部皮肤，迅速用眼科剪剪取模型组、对照组、试验A组及试验B组激光照射区皮肤，大小为1×1 cm2，将皮肤样本组织用生理盐水冲洗表面积血后放入20 ml容器中，4%多聚甲醛固定并封口，并用记号笔标记分组及取材时间。固定的标本用石蜡包埋、切片，HE染色。

1.5结果判定

1.5.1表皮、真皮厚度测定：空白对照组、模型组、试验A组、试验B组四组切片随机选取5个视野，光学显微镜下放大倍数为100倍及400倍，测量每个视野表皮、真皮的厚度，取其厚度的平均值作为表皮、真皮的厚度，单位为μm。

1.5.2炎性细胞数量的变化：空白对照组、模型组、试验A组、试验B组四组切片随机选取5个视野，光学显微镜下放大倍数为100倍及400倍，计数中性粒细胞、淋巴细胞数量的变化。

2 结果

2.1肉眼大体观察情况结果：见图1。

图1 对照组、模型组、试验组A、试验组B豚鼠皮肤外观：①对照组，皮肤平整饱满，无明显红斑、肿胀；②模型组，皮肤出现明显的红斑、肿胀、皱纹；③试验A组，皮肤饱满、红斑消退，皱纹减少；④试验组B，皮肤饱满、红斑消退，皱纹减少

2.2HE染色结果：对照组表皮层细胞排列整齐，真皮层胶原纤维排列整齐、致密，染色均一(见图2中①②)。模型组表皮变薄，细胞层数减少，排列紊乱，角质层上皮细胞角化不全；颗粒层变薄，见细胞变性、坏死，部分胞核碎裂，棘突变平。真皮层可见真皮浅层毛细血管扩张、数量增加，真皮血管周围可见较多的淋巴细胞、中性粒细胞浸润；真皮层胶原纤维数量减少，纤维排列紊乱、疏松(见图2中③④)。试验A组、试验B组与模型组相比表皮细胞层数增加，表皮增厚；真皮乳头层见较多的成纤维细胞，真皮网状层与模型组相比，胶原纤维数量增加，排列整齐、致密，染色增强，真皮层明显变厚(见图2中⑤～⑧)。模型组与对照组比较，真皮浅层淋巴细胞数量增多，试验A组、试验B组与模型组比较，真皮浅层淋巴细胞数量减少，中性粒细胞数量减少(见图2中⑥、⑧)。

图2 对照组、模型组、试验组A、试验组B豚鼠皮肤HE染色

组别例数表皮厚度(μm)真皮厚度(μm)淋巴细胞(/HP)中性粒细胞(/HP)对照组1027.60±1.09156.88±7.365.00±5.556.00±5.79模型组1020.87±1.11102.79±6.5445.00±7.4347.00±6.37试验A组1024.37±1.15130.68±7.5113.00±7.5214.00±7.15试验B组1025.12±1.37146.54±6.7926.00±6.5727.00±6.45

注：以上结果均在高倍×400下测得

3 讨论

实验证实如果皮肤局部长期使用强效糖皮质激素超过6周，就能导致皮肤表皮的角质形成细胞体积缩小，角质层的细胞层数减少，镜下只有2～3层细胞，而且细胞的结构也发生了异常；此外角质层透明层颗粒层细胞形成减少，最终使角质层变薄，甚至缺失[3]。从表1中可以看出，模型组豚鼠在使用强效激素60 d后，表皮层细胞层数较对照组减少，厚度变薄；真皮层成纤维细胞数量减少，胶原纤维数量减少，排列紊乱，真皮厚度较对照组变薄，差异有统计学意义(P<0.05)。

810 nm激光属于远红外光，使用多脉冲(双脉冲)、长脉宽(150 ms)、低强度功率(10 J/cm2)激光作用于人体可产生一系列生物刺激效应：波长>630 nm的红光，其穿透组织的深度较深，能够直接作用于皮肤的真皮层。Grossman等使用波长780 nm、能量密度为0.5 J/cm2的激光照射试管内的成纤维细胞，证实其能够显著促进成纤维细胞的增殖[4]；马长升等应用650 nm低能量半导体激光照射家兔皮肤伤口，也证实该波长的低能量激光刺激能够促进成纤维细胞的增殖而促进伤口的愈合[5]。以上都为本研究选择810 nm半导体激光治疗激素依赖性皮炎导致的皮肤萎缩提供了理论依据。

表1中，模型组豚鼠表皮在强效激素0.05%的氯倍他索作用下表皮细胞层数减少、变薄，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。810 nm半导体激光照射后，试验组A豚鼠的表皮细胞层数增加，厚度增厚，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；试验组B豚鼠的表皮细胞层数增加，厚度增厚，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但试验组A与试验组B比较，表皮增厚程度差异无统计学意义(P>0.05)。表1中模型组豚鼠真皮在药物作用下真皮层成纤维细胞数量减少，胶原纤维数量减少，排列紊乱，导致真皮厚度变薄，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。810 nm半导体激光照射后，试验组A真皮层见较多的成纤维细胞，与模型组相比胶原纤维数量增多，排列整齐、致密，差异有统计学意义(P<0.05)。试验B组真皮层见较多的成纤维细胞，与模型组相比胶原纤维数量增多，排列整齐、致密，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。试验B组与试验A组比较，真皮增厚更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果说明，低能量810 nm半导体激光照射激素依赖性皮炎豚鼠模型皮肤后，均能使其表皮厚度增加，但治疗间隔时间对其影响不大；低能量810 nm半导体激光治疗也均能使豚鼠模型皮肤真皮层的成纤维细胞增多，胶原纤维数量增多，排列更加致密和整齐，但试验组B治疗间隔时间为两周，较试验组A治疗间隔时间为一周真皮厚度增加更为明显，说明激光治疗对真皮的胶原纤维作用时效性可以一直延续，而且低能量的激光照射可产生良性的生物刺激，可见810 nm半导体激光在对激素依赖性皮炎导致的皮肤萎缩的治疗过程中治疗间隔为两周更为适宜。

Yano等、米新宾等在研究中发现，低强度激光并没有直接杀灭细菌的作用，但其可通过增加淋巴因子和溶菌酶的活性刺激吞噬细胞，抑制粒细胞的功能，从而起到抑制细菌作用，而且低强度激光的抑菌作用主要还和激光照射的强度、照射的时间和照射的次数有直接的关系[6-7]。当激光照射达到一定数值的能量密度时，就能够起到抑制细菌生长的作用。所以使用低强度激光照射在临床上治疗炎性疾病并不是通过直接杀灭细菌来达到治疗目的，而是通过低强度激光的光化学作用来实现其对炎症性疾病的治疗。Yano等通过实验证明低强度激光一方面能直接抑制部分细菌的生长[6]；另一方面通过低强度激光照射可提高溶菌酶和溶酶体酸性磷酸酶活性，增强巨噬细胞的吞噬功能，提高特异性和非特异性免疫的作用[8]。

表1中，模型组豚鼠与对照组相比，相同视野下，模型组炎性细胞(中性粒细胞和淋巴细胞)明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，说明长期使用激素或含激素类药物或化妆品均能使炎性细胞浸润的数量增加，从而导致皮肤产生炎性反应，使患者在临床上出现瘙痒、红肿、肿胀等症状。模型组A及模型组B在经过低强度激光照射后，相同视野下，真皮层中中性粒细胞和淋巴细胞数量较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。根据上述低强度激光对于皮肤炎性反应的治疗机制，说明低能量810 nm半导体激光对于激素依赖性皮炎所引起的炎细胞浸润能够起到一定的治疗作用。表1中，试验A组与试验B组相比较，试验A组炎性细胞数量的减少较试验B组更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，说明在激素依赖性皮炎的炎性反应急性期，缩短两次激光治疗的间隔时间(即一周激光照射一次)更能明显减轻炎性反应。可见810nm半导体激光在对激素依赖性皮炎导致的急性期炎性反应的治疗过程中，治疗间隔时间为一周更为适宜。

低能量810 nm半导体激光可刺激豚鼠激素依赖性皮炎表皮角质形成细胞的增殖，使角质形成细胞的层数增加，表皮层增厚，并可促进真皮成纤维细胞数量的增加，使胶原纤维数量增加，使真皮层增厚，对于激素依赖性皮炎所导致的皮肤菲薄萎缩及皮肤屏障的修复治疗间隔周期为两周更为适宜。低能量810 nm半导体激光可减少豚鼠激素依赖性皮炎炎性细胞浸润的数量，且在皮炎的急性期重复治疗间隔周期设定为一周更为适宜。