黄花柳花中黄酮类成分的薄层色谱分析及抗氧化活性研究

刘倩芸， 李新霞， 李雪俐， 迪娜·吐尔洪， 阳 莹， 李建光

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

黄花柳花为杨柳科柳属植物黄花柳(SalixcapreaL.)的干燥花穗，分布于我国新疆阿尔泰山、萨吾尔山的林缘、河谷[1]，主要的化学成分为黄酮、黄酮苷、挥发油、水杨苷、鞣质等成分[2,3]，具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、清除自由基、抗菌、滋补眼睛和退热的作用[4,5]，临床上多用于冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、风湿性关节炎等的治疗[6,7]。目前我国《药品标准》[8](维药分册)中收载以黄花柳花入药的复方制剂,无黄酮类成分的定性鉴别，本研究采用TLC法分析黄花柳花中黄酮类成分，采用薄层生物自显影技术[9,10]和DPPH自由基抗氧化模型分析研究黄花柳花中黄酮类成分的抗氧化活性，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器CAMAG LINOMAT 5型半自动点样仪(上海持互电子有限公司)，CAMAG REPROSTAR 3型薄层色谱数码成像系统(上海持互电子有限公司)，HHS-4S型水浴锅(上虞星星仪器设备有限公司)，HSC-12 A型氮吹仪(北京卓信伟业科技有限公司)，KQ3200型超声仪(昆山超声仪器有限公司)，AB135-S型分析天平(瑞士Mettler-Teledo公司)，双槽展开缸(20 cm×10 cm)，聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)。

1.2试药芦丁(成都普瑞科技有限公司，批号A120103)，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(成都普瑞科技有限公司，批号A110222)，甲醇(天津市致远化学试剂有限公司，批号20160120)，正庚烷(天津市福晨化学试剂厂，批号20170202)，正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20110105)，甲酸(天津市致远化学试剂有限公司，批号20160803)，十二烷基硫酸钠(天津市永晟精细化工有限公司，批号20170528，SDS)，2-氨基乙基联苯基硼酸酯(美国SIGMA-ALDRICH公司，批号BCBT0539，NP)，聚乙二醇400(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号20150303，PEG 400)，1,1-二苯基苦基苯肼(上海源叶生物科技有限公司，批号W14O7E22811，DPPH)，实验用水为超纯水。

1.3药材黄花柳花2017年4月购自新疆麦迪森维药有限公司，经新疆医科大学药学院帕丽达·阿布力孜教授鉴定为杨柳科柳属植物黄花柳(SalixcapreaL.)的干燥花穗。

2 方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取干燥黄花柳花，粉碎，过筛，称取粉末2 g，置于具塞锥形瓶中，加70%乙醇25 mL，超声处理30 min，放至室温，滤过，取续滤液作为供试品溶液(色谱图中记为EtOH)；同法用甲醇超声处理，取续滤液作为供试品溶液(色谱图中记为Meth)。

2.1.2 对照品溶液的制备 称取芦丁、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成一定浓度的混合对照品溶液。

2.1.3 NP-PEG显色剂的制备 取2-氨基乙基联苯基硼酸酯(diphenylboric acid aminoethyl ester，NP)、聚乙二醇400(PEG 400)，用甲醇制成1%的NP甲醇溶液和5%的PEG 400甲醇溶液，显色时先喷NP，后喷PEG 400。

2.1.4 DPPH显色剂的制备 称取DPPH对照品2.01 mg，置于100 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，配成浓度为0.02 mg/mL的溶液。

2.1.5 展开剂的制备 微乳液的制备：SDS-正丁醇-正庚烷-水质量比(0.27∶0.63∶0.10∶3.00)，搅拌溶解，混匀，放置24 h即得含水量为75%的微乳液，使用前与甲酸配制成展开剂。

2.1.6 Vc对照品溶液的制备 称取Vc对照品5.43 mg，置于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配成浓度为0.543 mg/mL的Vc对照品溶液。

2.1.7 黄花柳花样品溶液的制备 称取干燥黄花柳花粉末2.51 g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声处理30 min，放至室温，取上清液滤过，取续滤液即得浓度为0.050 2 g/mL的黄花柳花样品溶液。

2.1.8 DPPH溶液的制备 称取DPPH对照品4.02 mg，置于500 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配成浓度为0.008 mg/mL的溶液。

2.2黄花柳花提取物中黄酮类成分微乳薄层色谱方法的建立

2.2.1 不同检视方式的考察 分别吸取对照品溶液和黄花柳花供试品溶液2 μL和4 μL，点于同一聚酰胺薄膜板上，以含水量75%微乳液-甲酸(9∶2)为展开系统展开，取出，晾干，喷NP-PEG显色，晾干，分别置于紫外光254 nm、366 nm和白光下检视。结果显示：紫外光366 nm下检视，对照品芦丁显示亮黄色斑点，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷显示绿色斑点，供试品条带有9个斑点，斑点数目最多，也最清晰；70%乙醇提取物与甲醇提取物相比，都显示相同斑点，因此确定供试品处理方法为70%乙醇超声提取，见图1-3。

图1黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(254nm)

图2黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(366nm)

图3黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(白光)

(混标：A为芦丁、B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷， EtOH：黄花柳花70%乙醇提取，Meth：黄花柳花甲醇提取)

2.2.2 展开剂中甲酸含量的考察 按“2.2.1”项下方法点样，分别以含水量75%微乳液-甲酸(9∶0、9∶0.5、9∶1、9∶2、9∶3)展开，至溶剂前沿距原点8 cm，取出，晾干，喷NP-PEG显色，晾干，置于紫外光366 nm下检视。结果显示：以75%微乳液-甲酸(9∶0.5)展开时，芦丁和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的Rf值分别为0.6和0.4，供试品条带斑点清晰，分离度良好，见图4-8。

2.2.3 微乳液中含水量的考察 在SDS-正丁醇-正庚烷质量比为0.27∶0.63∶0.10保持不变的条件下，改变水量，配制含水量15%、30%、45%、60%、75%、90%系列微乳液，搅拌溶解，放置24 h即可。以上述系列微乳液-甲酸(9∶0.5)为展开剂，考察微乳液含水量对黄花柳花供试品溶液展开效果的影响。根据各斑点的Rf值、分离效果，选择最佳微乳液作为展开剂。结果显示：微乳液含水量为75%时，芦丁和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的Rf值分别为0.7和0.52，Rf值合适，斑点清晰，分离度较好，选择含水量75%微乳液-甲酸(9∶0.5)为最佳展开系统，见图9-14。

图4黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(75%微乳液∶甲酸=9∶0)

图5黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(75%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

图6黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(75%微乳液∶甲酸=9∶1)

(混标：A为芦丁，B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，EtOH：黄花柳花70%乙醇提取)

2.2.4 不同点样量的考察 分别吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液和“2.1.1”项下黄花柳花供试品溶液2、4、6、8、10 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，按“2.2.3”项下选择的最佳展开系统展开，至溶剂前沿距原点8 cm，取出，晾干，喷NP-PEG显色，晾干，置紫外光366 nm下检视。结果表明混合对照品的点样量为2 μL时斑点清晰，供试品点样量为6 μL时斑点条带清晰，条带宽度合适，见图15。

图7黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(75%微乳液∶甲酸=9∶1.5)

图8黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(75%微乳液∶甲酸=9∶2)

图9黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(15%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

图10黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(30%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

(混标：A为芦丁、B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，EtOH：黄花柳花70%乙醇提取)

图11黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(45%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

图12黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(60%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

图13黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(75%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

图14黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图(90%微乳液∶甲酸=9∶0.5)

(混标：A为芦丁、B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，EtOH：黄花柳花70%乙醇提取)

图15 黄花柳花黄酮类成分不同点样量TLC色谱图

2.2.5 系统验证 分别吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液2 μL和“2.1.1”项下黄花柳花供试品溶液6 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以含水量75%微乳液-甲酸(9∶0.5)展开，取出，晾干，喷NP-PEG显色，晾干，置紫外光366 nm下检视，黄花柳花供试品条带在与芦丁、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷混合对照品相应的位置上，出现Rf值相同的亮黄色和绿色斑点，Rf值分别为0.6和0.4，供试品条带显示8个斑点，斑点清晰，且分离度好，此方法可用于黄花柳花黄酮类成分的定性鉴别，见图16。

图16 黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图

(混标：A为芦丁、B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，EtOH：黄花柳花70%乙醇提取)

2.3UV-vis法测定黄花柳花黄酮类提取物总的抗氧化活性

2.3.1 Vc对DPPH的清除能力测定 吸取DPPH溶液2 mL加入甲醇2 mL，在516 nm下测定吸光度A0；吸取DPPH溶液2 mL，加Vc系列液和甲醇各1 mL，30℃水浴0.5 h后，在516 nm测定一系列吸光度Ai；吸取甲醇3 mL加入相对应Vc系列液1 mL，在516 nm测定一系列吸光度Aj；按照清除率公式计算Vc对DPPH的清除率。以清除率表示抗氧化能力的强弱：清除率S/%=[1-(Ai-Aj)/A0×100%](A0为DPPH与甲醇混合液的吸光度；Ai为DPPH与样品反应0.5 h后的吸光度；Aj为样品与甲醇混合液的吸光度)。计算结果表明Vc对DPPH的清除能力与浓度呈量效关系，清除50% DPPH的Vc浓度(IC50)为16.7 μg/mL，说明用本方法判定抗氧化能力是可行的。

2.3.2 黄花柳花黄酮类成分对DPPH的清除能力测定 分别吸取适量黄花柳花样品溶液，配成黄花柳花系列溶液，按“2.3.1”项下方法测定黄花柳花系列液的A值，按照清除率公式计算黄花柳花对DPPH的清除率，黄花柳花供试品浓度(IC50)为2.4 mg/mL，见图17。

图17 不同浓度黄花柳花黄酮类成分对DPPH的清除率

2.4薄层生物自显影技术分析黄花柳花抗氧化活性分别吸取混合对照品溶液2 μL、黄花柳花供试品溶液6 μL，点于聚酰胺薄膜上，以含水量75%微乳液-甲酸(9∶0.5)展开，晾干，喷NP-PEG显色，置紫外光366 nm下检视，结果显示，黄花柳花供试品条带有9个斑点，见图18。另取一张板同法展开后，喷DPPH显色剂溶液，直到呈现紫色背景，在白光下检视，结果显示喷DPPH显色剂后，在紫色背景下显白色斑点的成分具有抗氧化活性，黄花柳花供试品有6个白色斑点，本次研究定性出了黄花柳花供试品中的芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和芦丁，并且均具有抗氧化活性。除此之外，供试品中还有其他未知抗氧化成分，见图19。检视后在360 nm波长下对具有抗氧化活性的斑点进行扫描，计算扫描得到的斑点面积和所占比例，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Rf值为0.56)占总抗氧化活性的7.84%；芦丁(Rf值为0.65)占总抗氧化活性的4.51%；其余未知成分中有5个斑点的抗氧化活性均大于这2个成分，对未知抗氧化活性的成分有待进一步探究，见表1。

图18 黄花柳花黄酮类成分TLC色谱图

(混标：A为芦丁、B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，EtOH：黄花柳花70%乙醇提取)

图19 黄花柳花黄酮类成分薄层生物自显影TLC图

(混标：A为芦丁、B为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，EtOH：黄花柳花70%乙醇提取)

表1 薄层扫描法测定黄花柳花中黄酮类成分抗氧化活性斑点面积

3 讨论

本研究先采用硅胶薄层色谱，以冰醋酸-水-正丁醇(17∶17∶66)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)为展开剂进行展开，发现这2个条件下供试品斑点模糊，分离度差，因此采用文献[11]中微乳薄层色谱法建立黄花柳花薄层色谱鉴别条件。对黄酮类化合物鉴定时使用NP-PEG显色时，聚乙二醇溶液降低了检测限并增加荧光强度，在紫外光366 nm下产生强烈的荧光，因此本实验选用NP-PEG显色。本研究考察了不同检视方式、展开剂中甲酸用量、展开剂含水量以及点样量等因素，对黄花柳花黄酮类成分聚酰胺薄层色谱分离的影响，以含水量75%微乳液-甲酸(9∶0.5)为最佳展开系统，喷NP-PEG显色，置紫外灯366 nm下检视。建立了70%乙醇超声提取黄花柳花供试品中黄酮类成分TLC鉴别方法，供试品分离条带中有8个斑点，指认出其中2个，为芦丁和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。黄花柳花抗氧化活性实验发现黄花柳对DPPH的清除能力与浓度呈量效关系，计算得到黄花柳花供试品的半数抗氧化浓度(IC50)为2.4 mg/mL。薄层生物自显影结果显示，黄花柳花中的芦丁和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷均具有抗氧化活性，扫描后发现黄花柳花中芦丁占总抗氧化性的4.51%，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷占总抗氧化性的7.84%，此外，供试品条带中还有其他3个未知成分斑点具有抗氧化活性，原点也有未知抗氧化成分没有分离出来，对这些未知斑点的确认有待进一步研究。