超高效液相色谱-串联质谱法同时测定 胡柚中9种功能性成分

雷美康，冯敬骞，徐思绮，彭芳，祝子铜，叶有标，徐佳文，韩超

(1.衢州出入境检验检疫局技术中心，浙江 衢州 324003； 2.衢州职业技术学院，浙江 衢州 324000； 3.温州出入境检验检疫技术中心，浙江 温州 325027)

胡柚(Citruschangshan-huyouY. B. Chang)为浙江特有的柚类资源，主要分布在常山、衢江、柯城、龙游、江山、开化等地，果实具有丰产、抗冻、适应性强、特耐贮藏，及贮藏后品质更佳的特性[1-3]。胡柚中有大量黄酮类、萜类化合物和酚酸等活性成分[2,4]，营养丰富，不仅是美味的食用水果，还具有很高的药用价值。近年，常山胡柚片更是以“衢枳壳”名义列入《浙江省中药炮制规范》[5]。作为功能食品基料和药品原料，胡柚具有广阔的应用和开发前景。

随着对胡柚保健功能认识的逐步加强，人们对胡柚果皮和果肉中主要功能性成分的含量也越来越关注[6-10]，但关于胡柚不同部位中多种功能性成分含量的同时测定方法一直未见文献报道。本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定胡柚中不同部位9种功能性成分的分析方法。该方法操作简便，灵敏度高、结果准确，现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

胡柚样品购自水果市场，经溯源，均来自浙江省衢州市常山县。

标准品：橙皮苷(CAS 520-26-3，纯度97.06%)，新橙皮苷(CAS 13241-33-3，纯度98.76%)，橙皮素(CAS 520-33-2，纯度98.45%)，柚皮苷(CAS 10236-47-2，纯度99.33%)，芸香柚皮苷(CAS 14259-46-2，纯度99.38%)，柚皮素(CAS 480-41-1，纯度98.09%)，柠檬苦素(CAS 1180-71-8，纯度99.08%)，诺米林(CAS 1063-77-0，纯度99.32%)，圣草次苷(CAS 13463-28-0，纯度98.16%)，均购自上海安谱实验科技股份有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，实验用水为超纯水。

Ultimate 3000超高效液相色谱-TSQ Vantage三重四极杆串联质谱联用仪，美国Thermo Scientific公司；Multifuge X1R离心机，美国Thermo Scientific公司；高速粉碎机(200 g)，浙江屹立工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

精确称取9种功能性成分的标准品10 mg(精确至0.1 mg)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，混匀，配制成1 mg·mL-1的单标储备液。根据需要移取适量储备液，用甲醇-水(体积比1∶1)稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4 ℃冰箱中。如橙皮苷不易溶解，可加入适量的乙酸铵。

1.2.2 试样制备

将采集的胡柚经超纯水清洗擦干后，分为果皮和果肉两部分，分别取适量样品搅碎、混匀，备用。

1.2.3 样品前处理

称取果皮0.5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞塑料离心管中，准确加入10 mL甲醇-水(体积比6∶4)溶液，超声提取5 min，8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，提取2次，合并提取液过0.22 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

称取果肉2.0 g(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞塑料离心管中，准确加入10 mL甲醇-水(体积比6∶4)溶液，超声提取5 min，8 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Accucore XL C18柱(150 mm×4 mm，4.6 μm)；柱温：35 ℃；进样量：50 μL；流速：0.5 mL·min-1。流动相：A为甲醇，B为0.15%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～1.0 min，30%A、70%B；1.0～14.0 min，30%A～65%A、70%～35%B；14.0～14.1 min，65%A～95%A、35%～5%B；14.1～20.0 min，95%A、5%B；20.0～20.1 min，90%A～30%A、10%B～70%B；20.1～22.0 min，30%A、70%B。

1.2.5 质谱条件

离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：正负离子切换扫描模式；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：+3 500(-3 000)V；毛细管温度(capilirry temperature)：270 ℃；干燥气流量(gas flow)：10 L·min-1；喷雾气压力(Nebulizer)：45 psi(英制单位，仪器系统中使用，45 psi约合0.31 MPa)；鞘气温度(sheath gas temp)：350 ℃；鞘气流速(sheath gas flow)：30 L·min-1。

2 结果与分析

2.1 样品处理方法优化

2.1.1 提取方法

胡柚中功能性成分的提取方法主要有索氏提取法和超声辅助提取法2种。因超声辅助提取法具有操作简便、快速、提取效率高等优点，所以本实验选择超声辅助提取法提取胡柚中9种功能性成分。

2.1.2 提取液

比较不同体积比的甲醇-水溶液作为提取液对胡柚果肉和果皮中9种成分提取效率的影响，当采用甲醇-水(体积比6∶4)作为提取液时，提取率接近100%，提取较为充分。

2.1.3 提取次数

比较不同提取次数对胡柚果肉和果皮中9种成分提取效率的影响，果皮一次提取后提取率为75%～90%，2次提取后，提取率接近100%，而果肉经1次提取后，提取率即达到94%以上。据此认为，果肉提取1次即可，而果皮须提取2次。

2.2 色谱条件优化

考查甲醇-水(A)、乙腈-水(B)、甲醇-0.15%甲酸溶液(C)、乙腈-0.15%甲酸溶液(D)等4组流动相体系对圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柠檬苦素、柚皮素、橙皮素、诺米林等9种目标分析物的分离效果和峰信号强度。结果表明，9种目标分析物在甲醇-0.15%甲酸水溶液体系下各色谱峰分离效果和峰信号响应值最佳，故选择甲醇-0.15%甲酸溶液作为分离9种化合物的流动相。由此得到9种功能性成分的多反应监测色谱图(图1)。

1，圣草次苷；2，芸香柚皮苷；3，柚皮苷；4，橙皮苷；5，新橙皮苷；6，柚皮素；7，柠檬苦素；8，橙皮素；9，诺米林图1 功能性成分的多反应监测色谱

2.3 质谱条件优化

取标准品溶液采用流动注射法直接进样，分别在电喷雾电离源的正离子和负离子模式下进行扫描。确定各化合物的母离子，分别优化质谱的S-Lens电压、碰撞能量等参数，进行子离子扫描，选取2种丰度强、稳定的碎片离子作为定量与定性离子。

芸香柚皮苷与柚皮苷为同分异构体，实验表明，芸香柚皮苷的[M+H]+离子信号强度大于[M-H]-，而柚皮苷的[M+H]+离子信号强度弱于[M-H]-。橙皮苷与新橙皮苷互为同分异构体，实验表明，橙皮苷的[M+H]+离子信号强度大于[M-H]-，而新橙皮苷的[M+H]+离子信号强度弱于[M-H]-。

实验发现，毛细管温度对诺米林的离子加合物形态有较大的影响。当毛细管温度在270 ℃左右时，诺米林的[M+H]+准离子峰信号最强。

优化后的保留时间、质荷比、碰撞能量、S-Lens电压和扫描模式详见表1。

表1 各功能性成分的多反应监测质谱参数

注：标*的为定量离子。

2.4 方法的线性范围和定量限

配制一系列不同浓度的混合标准工作溶液，依次进样，分别以9种功能性成分的峰面积为纵坐标(y)，以相应的进样浓度为横坐标(x)，做标准曲线。结果表明，9种功能性成分在0.01～5 μg·mL-1，浓度与峰面积线性良好。以实际检测时的信噪比大于10确定定量限。9种功能性成分的标准曲线、决定系数、线性范围、定量限见表2。

表2 各功能性成分检测的线性范围、检出限及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

分别以果皮和果肉中9种功能性成分本底值的50%、100%和200%水平进行加标回收实验，每个水平重复测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差，结果如表3所示，均符合检测要求。

2.6 各功能性成分含量的检测结果

取2个样品，分别分为果肉和果皮2部分，按前述方法测定各功能性成分的含量，每个样品重复2次，取平均值，结果见表4。说明本方法可以同时测定胡柚中9种功能性成分的含量。

3 小结

本实验建立起一种基于超高效液相色谱-串联质谱同时检测胡柚中9种功能性成分的分析方法。具体地：将胡柚样品分为果皮和果肉2部分，果皮经甲醇-水(体积比6∶4)超声波提取2次(每次5 min)、果肉经甲醇-水(体积比6∶4)超声波提取1次(5 min)后，采用Accucore XL C18柱(150 mm×4 mm，4.6 μm)分离，以甲醇-0.15%甲酸溶液为流动相梯度洗脱，在电喷雾离子源正负离子切换多反应监测模式串联质谱下检测，外标法定量。本文方法对胡柚中9种功能性成分进行同时检测时，样品浓度与峰面积线性良好，决定系数大于0.997，加标回收率在83.6～116.2%，相对标准偏差在1.58～8.33%(n=6)。该方法快速、灵敏、准确，适用于胡柚中9种功能性成分的同时定性和定量检测。

表3 各功能性成分检测的加标回收率和相对标准偏差

表4 胡柚(果皮和果肉)中9种功能性成分的含量检测结果 mg·kg-1