200例无精症患者染色体核型分析及Y染色体AZF基因微缺失情况观察

师志云，陈源昊琪，于辛酉，马一婧，王青，贾伟

(1宁夏医科大学总医院，银川750001；2宁夏医科大学；3宁夏临床病原微生物重点实验室)

在育龄期夫妇中，不育症患者占15%，其中男方因素占50%[1]。在男性不育症患者中，有50%是由精液异常引起的，其中无精子症和严重少精子症占0.7%[2]。Y染色体长臂上的无精子因子(azoospermia factor，AZF)对精子的生成起着重要的作用，因其携带了精子发生所需的重要遗传信息[3]。Y染色体的AZF微缺失是继Klinefelters综合征后导致男性不育的第二大原因[4]。卵浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术已成功应用于临床，使不育症患者拥有自己的后代成为可能，但Y染色体AZF微缺失可能通过这种辅助生殖技术遗传给后代[5]，所以无精、少精患者在ICSI治疗前应筛查Y染色体AZF微缺失。本研究对200例无精症患者进行了染色体核型分析及Y染色体AZF基因微缺失观察。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017年1～12月在宁夏医科大学总医院就诊的无精症患者200例，年龄23～32岁。按照WHO《人类精液检验与处理实验室手册》进行精液分析确诊为无精症。200例患者均排除器质性病变(精索静脉曲张、附睾疾病、生殖内分泌疾病及其他泌尿生殖系统等)、病毒感染，未患过腮腺炎、睾丸炎、附睾炎，未服用过对生殖系统可能造成损伤的药物。患者对本研究知情同意。采集患者外周血5 mL，肝素钠抗凝备用。

1.2 染色体核型分析 取患者外周血进行淋巴细胞培养后，按常规制备染色体(23对所有染色体)标本，G显带镜检至少20个中期分裂相细胞，分析3～5个核型。根据人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)对染色体进行染色体核型描述。

1.3 Y染色体AZF基因检测 ①外周血DNA的提取：采用康为试剂公司的血液基因组柱式小量提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，按照试剂盒说明书提取DNA，DeNovix核酸蛋白测定仪测定所提取到的DNA含量，-20 ℃保存。②Y染色体AZFa、AZFb、AZFc区域6个序列标签位点(STS)的多重PCR凝胶电泳检测：受检Y染色体AZFa区STS为SY84、SY86，AZFb区STS为SY127、SY134，AZFc区STS为SY254、SY255。同时设置两个内对照基因(男性性别决定基因SRY和编码锌指蛋白基因ZFX/ZFY)进行扩增，并选用正常生育男性、正常女性和双蒸水分别作阳性、阴性和空白对照。实验方法严格按照试剂盒说明书进行。核酸电泳PCR产物10 μL，经2%琼脂糖凝胶电泳(120 V,30 min)，观察DNA电泳条带。结果判读：电泳后目的基因片段显示扩增条带，质控品均在控，该基因位点存在；电泳结果未见扩增基因显带，且重复2次仍无显带，质控品均在控，该基因位点缺失。③ Y染色体AZFa、AZFb、AZFc区域6个序列标签位点的荧光定量PCR检测：选取上海透景生命科技有限公司AZF检测试剂盒，Y染色体AZFa、AZFb、AZFc区受检STS同上，同时设置一对内对照SRY基因进行扩增，通过扩增曲线直接观察结果。结果判读：所有标本均应扩增出SRY对照条带，若所测样品中无此条带，提示实验失败；出现一个或多个STS条带丢失，质控品均在控，即可判断为其对应的STS缺失。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 染色体核型分析结果 200例无精症患者中，发现9例染色体异常(占4.5%)，其中性染色体异常8例[包括4例Y等臂、2例47,XXY、1例inv(Y)、1例染色体多态Yqh+]、常染色体易位1例。

2.2 Y染色体AZF基因微缺失检测结果 200例无精症患者中Y染色体AZF基因微缺失的患者共有18例(总缺失率为9.0%)。其中AZFb+AZFc区缺失11例、AZFc区缺失5例、AZFb区缺失1例、AZFa区缺失1例，详见表1。 多重PCR凝胶电泳和荧光定量PCR两种方法检测结果一致。

表1 18例Y染色体AZF基因微缺失情况

2.3 9例染色体异常者的Y染色体AZF基因微缺失情况 200例无精症患者中的9例染色体异常者，伴有Y染色体AZF基因微缺失的有6例，详见表2。

表2 9例染色体异常者的Y染色体AZF基因微缺失情况

3 讨论

染色体异常是精子发生障碍的重要原因。本研究发现，200例无精症患者中染色体异常者占4.5%(9/200)，与以往报道[6,7]的无精症患者染色体异常率为2.2%～19.6%相近。染色体结构或数目异常会导致男性出现无精子、少精子或弱精子的临床表现，是导致男性不育的重要因素之一。本研究从200例无精症患者中检出性染色体异常8例，包括4例Y等臂，1例克氏综合征常见的染色体核型47,XXY(即出现两条以上的X染色体)，表明性染色体异常对生精功能影响最大，这与文献[8,9]报道相符；检出常染色体异常1例(0.5%)，这个比例低于文献[10]报道的1.1%～7.2%。性染色体异常的8例中染色体多态1例(0.5%)，也远远低于文献[11]报道的12.2%～38%。后期我们需要增大样本例数，提高研究结果的客观性。

Y染色体微缺失和染色体异常是导致男子无精子症和少精子症的重要遗传因素[12]。Y染色体AZF基因可划分为AZFa、AZFb、AZFc3个不同区域，AZFa区缺失可导致唯支持细胞综合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)，临床表现为无精子症[13]；AZFb和AZFb+AZFc整段缺失的患者典型睾丸组织学特征为SCOS或生精阻滞；AZFc缺失患者残存了精子生成能力，多见于无精子症或者严重少精子症患者[14]。国内外不同实验室报道的AZF基因总微缺失率跨度很大，为1%～55%[15]。本研究对200例无精症患者进行AZF基因微缺失检查，总体缺失率为9.0%，位于上述范围但相对偏低，可能由于各实验室选择对象来自的地域不同有关，不排除其缺失率存在地域差异的可能。本研究发现，无精症患者Y染色体AZF基因的AZFb+AZFc区域缺失最常见，其次为AZFc区域缺失，AZFa区域和AZFb区域缺失最少见，与文献[16]报道的亚洲西南地区无精症患者Y染色体微缺失率10%、缺失位点多数在AZFc区大致相同。

多重PCR凝胶电泳技术是我国Y染色体微缺失分子诊断指南(草案)推荐使用的方法，此方法可检测STS较多，价格较实时荧光定量PCR技术便宜，但此方法有较多局限性，比如操作自动化不高，在检测大批量样本时十分耗时耗力，而且在电泳时需加入溴化乙锭，操作时容易污染实验室。而荧光定量PCR检测操作简单，通过扩增曲线直接观察结果，无需PCR后进行凝胶电泳，该方法比多重PCR凝胶电泳技术节约大量时间，减少工作量，提高临床检验工作效率。本研究结果显示，多重PCR凝胶电泳技术和荧光定量PCR技术对200例无精症患者AZF基因的6个位点的检测结果完全一致。

综上所述，无精症患者染色体核型异常及Y染色体AZF基因微缺失多见，可能是男性不育的重要原因。对于男性不育患者，检测Y染色体AZF基因的微缺失是必要的，可明确无精子、少精子症的发病原因，为患者接受辅助生殖治疗和遗传咨询提供帮助。本研究分别采用多重PCR电泳技术与荧光定量PCR技术对无精症患者的Y染色体AZF基因进行检测，结果一致，荧光定量PCR技术更省时省力，因此适用于Y染色体AZF基因微缺失的筛查。