卵巢癌组织中泛素连接酶SIAH2、HIF-1α蛋白的表达观察

甄娟，刘玉东，宋春红，朱玉芬，王莉，毕学杰

(1 石家庄市第四医院，石家庄050000；2 河北省人民医院)

SIAH2是一种高度保守的泛素连接酶，基因定位于染色体3q25，编码324个氨基酸。SIAH2蛋白具有泛素连接酶的活性，可调节一些蛋白的泛素化和降解，并通过其作用的底物在细胞周期、低氧应激及信号转导通路调节中发挥重要作用。近年来研究[1]发现，SIAH2可作为一种重要的肿瘤因子，在某些肿瘤的发生发展中发挥重要作用，SIAH2在有增殖能力的细胞中表达(正常细胞和肿瘤细胞)，如人胚肾细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞及结直肠腺瘤细胞等，而在不增殖的细胞中表达缺失。SIAH2在肺癌[2]、急性T淋巴细胞白血病[3]、卵巢癌[4]、乳腺癌[5]组织中均呈高表达，并且随着肺癌及乳腺癌分化程度的降低其表达显著增加。Malz等[6]研究发现，SIAH2与肝癌的复发和转移密切相关，因此SIAH2是作为一种癌基因在肿瘤的发生发展和转移过程中发挥其作用的。SIAH2在卵巢癌中的表达及临床意义罕有报道。低氧诱导因子1α(HIF-1α)在细胞低氧反应中发挥关键作用，其表达与肿瘤的生成和转移有关。研究[7,8]发现，SIAH2能够调节HIF-1α的表达，从而使其在细胞低氧反应及肿瘤转移中发挥作用，SIAH2可通过SIAH2/HIF-1α途径调控肿瘤的生长和转移。本研究对卵巢癌组织中的SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白进行了定性及定量检测，观察其表达变化，探讨SIAH2在卵巢癌发生发展及转移中的作用及其与HIF-1α的关系，为卵巢癌的诊断和治疗寻找新的生物学标志物及药物治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012～2017年在石家庄市第四医院接受手术治疗的卵巢癌患者57例、卵巢囊肿患者55例、卵巢交界性肿瘤患者40例，术前未接受放化疗及激素治疗，术中均留取肿瘤组织[其中35例卵巢癌患者手术时一并留取癌旁组织(距离癌组织>2 cm)]。肿瘤组织和癌旁组织离体后立即放入液氮-70 ℃保存，受检时切片，先行HE常规染色后进一步明确诊断，由两名病理医师根据卵巢肿瘤WHO分类标准和FIGO分期标准确定肿瘤的组织病理类型及病理分期。

1.2 主要试剂 链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶S-P试剂盒和DAB显色试剂均购自福州迈新生物技术开发公司，SIAH2鼠单克隆抗体(sc-81787)和HIF-1α鼠单克隆抗体(sc-13515)均购自美国Santa Cruz公司。

1.3 卵巢癌、卵巢囊肿、卵巢交界性肿瘤患者肿瘤组织中SIAH2、HIF-1α蛋白的定性检测 采用免疫组化SP法。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白均以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色。每张受检组织切片在光镜下随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数200个瘤细胞，总计1 000个瘤细胞：SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白阳性细胞百分比为0计0分、≤50%计1分、>50%～≤75%计2分、>75%计3分；细胞无着色计0分、浅黄色计1分、棕黄色计2分、黄褐色计3分。上述两分值的乘积<4为阴性、≥4为阳性。

1.4 卵巢癌患者肿瘤组织及癌旁组织中SIAH2、HIF-1α蛋白的定量检测 采用Western blotting法。受检组织切片进行蛋白质免疫印迹，12%SDS-PAGE电泳，一抗(SIAH2 1∶150，HIF-1α 1∶150)和β-actin(1∶200)4 ℃孵育过夜，与相应二抗室温下孵育2 h，ECL发光，拍照并进行计算机图像分析，用Image J软件半定量分析特异性条带的光密度值，将β-actin光密度值作为内参照，对目的蛋白(SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白)的相对表达量进行分析。实验至少重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 卵巢癌、卵巢囊肿、卵巢交界性肿瘤患者肿瘤组织中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的定性检测结果比较 卵巢囊肿、卵巢交界性肿瘤、卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的阳性表达率分别为7.27%和10.9%、47.5%和42.5%、78.9%和80.7%，两两相比，P均<0.05。卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白的阳性表达呈正相关(r=0.402，P<0.05)。卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白的表达与肿瘤分化程度、FIGO分期和淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者年龄及肿瘤组织学类型无关(P均>0.05)，详见表1。

表1 卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的阳性表达与患者临床病理参数的关系(例)

2.2 卵巢癌患者肿瘤组织、癌旁组织中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白的定量检测结果比较 卵巢癌患者肿瘤组织、癌旁组织中SIAH2蛋白的相对表达量分别为2.518±0.18、2.016±0.142，两者相比，P<0.05；卵巢癌患者肿瘤组织、癌旁组织中HIF-1α蛋白的相对表达量分别为1.41±0.14、0.75±0.13，两者相比，P<0.05。卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白的表达呈正相关(r=0.408，P<0.05)。

3 讨论

SIAH2蛋白的作用底物包括PHD1/3、Spry2[1]、CHK2[9]、PI3K[10]等，一些底物通过自身AXVXP基因序列或衔接蛋白与SIAH2结合，一些底物直接与SIAH2结合，从而影响多种细胞功能，如信号转导、细胞分化、线粒体生物合成、低氧和应激反应等。Sun等[11]研究发现，过表达SIAH2蛋白能够促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力，抑制SIAH2蛋白的表达可以减慢乳腺癌的生长和减少肿瘤的扩散转移，推测SIAH2基因是一种癌基因。本研究发现，SIAH2蛋白在卵巢良性病变、交界性肿瘤、卵巢癌患者肿瘤组织中的阳性表达率依次升高，SIAH2蛋白在卵巢癌患者肿瘤组织中的相对表达量高于癌旁组织，推测SIAH2蛋白作为肿瘤促进因子在卵巢癌的发生发展过程中发挥作用。本研究还发现，卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白的阳性表达随着FIGO分期的增加而增加，且在低分化、淋巴结转移的卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白的阳性表达率较高，这与文献[4]报道一致。推测SIAH2蛋白可以作为卵巢癌诊断的生物学标志物，也可以作为卵巢的药物治疗靶点，并且可以预测卵巢癌患者的预后。

HIF-1蛋白是非常重要的一种核转录因子，主要由α和β两个亚基构成，α亚基是其主要的功能单位。正常情况下，细胞内的泛素-蛋白酶系统能够将HIF-1α蛋白降解，所以HIF-1α蛋白很难被检测到[12]。当细胞处于缺氧状态时，细胞内的HIF-1α蛋白稳定性提高，浓度逐渐增加，将会启动其下游多种靶基因的转录，而HIF-1α下游靶基因的蛋白产物与肿瘤血管生成、浸润转移、增殖和凋亡密切相关[13]。肿瘤在低氧时就会诱导HIF-1α表达上调，而HIF-1α表达上调就会使血管内皮生长因子表达上调，进而使肿瘤形成更多的新生血管，促进肿瘤的生长与转移[13～16]。由此可见，HIF-1α蛋白的高表达为肿瘤细胞生长提供了血供，为肿瘤细胞转移开辟了道路，预示着肿瘤有较高的侵袭性。本研究结果显示,HIF-1α蛋白在卵巢癌患者肿瘤组织中高表达，而且FIGO分期较晚、分化程度低、淋巴结转移的卵巢癌患者肿瘤组织中HIF-1α蛋白表达水平较高。推测HIF-1α参与卵巢癌发生发展，并与肿瘤浸润和转移有关。

研究[4]发现，在急性T淋巴细胞白血病中抑制SIAH2的活性后，通过PHD3调节HIF-1α的表达，可抑制白血病细胞的增殖和转移，促进其凋亡。本研究结果显示，SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白在卵巢癌癌变过程中的阳性表达率同时依次升高，并且在卵巢癌患者肿瘤组织中二者的相对表达量均显著高于癌旁组织，卵巢癌组织中SIAH2蛋白与HIF-1α蛋白表达呈正相关，二者均与肿瘤分化程度、FIGO分期及淋巴结转移有关。以上这些结果提示SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白具有协同作用，与卵巢癌发生及转移相关。推测HIF-1α蛋白可能是SIAH2的蛋白一种底物。

总之，本研究发现，卵巢癌患者肿瘤组织中SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白高表达；SIAH2蛋白和HIF-1α蛋白可能与卵巢癌的发生及转移有关，且二者可能具有协同作用。SIAH2作为一种重要的肿瘤因子，研究其上下游调控关系，可为进一步探讨其作为卵巢癌药物治疗靶点及预后判断指标提供理论依据。