微小RNA-378转染对卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响及其机制

陈小平，任新萍，杜依蓓，薛金玲

(盐城市第一人民医院，江苏盐城224000)

卵巢癌是死亡率最高、预后最差的女性恶性肿瘤[1]。早期卵巢癌的临床表现不明显，缺乏特异、灵敏的早期诊断指标，导致大多数患者确诊时已处于Ⅲ期或Ⅳ期，患者5年总生存率低，预后差[2]。寻找新的卵巢癌治疗靶标、提高治疗效率是目前肿瘤研究领域的热点之一。微小RNA(即miRNA)是约22个核苷酸组成的单链非编码RNA，可通过与信使RNA(即mRNA)互补结合，负向调控靶基因表达。在肿瘤组织和细胞中，表达增加的miRNA分子具有促癌基因功能，相反，表达降低的miRNA分子具有抑癌基因功能[3]，在不同肿瘤组织中，miRNA分子可兼具促癌基因和抑癌基因的功能。miRNA具有作为肿瘤治疗靶点的潜能。miRNA-378在多种恶性肿瘤中异常表达，如miRNA-378可抑制结肠癌细胞增殖和侵袭迁移[4]、抑制胃癌细胞增殖[5]等，Xu等[6]发现miRNA-378参与卵巢雌二醇生成[6]，而关于其在卵巢癌中的功能和作用机制的相关研究甚少。我们的前期研究结果发现，miRNA-378通过降低c-Myc表达而抑制卵巢癌细胞增殖。2016年9月15日～2017年11月15日，我们观察了miRNA-378转染对卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响，并初步探讨其作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、miRNA-378过表达质粒、试剂与仪器 人卵巢癌细胞株SKOV3、人源胚胎肾细胞HEK-293T细胞(包被慢病毒的工具细胞)购自美国ATCC公司。慢病毒包装系统购自北京合生基因科技有限公司，miRNA-378过表达质粒、空白载体质粒购自山东维真生物科技有限公司。PMI1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，嘌呤霉素购自美国Sigma公司，TRIzol溶剂购自美国Invitrogen公司，Real-time PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，RIPA裂解液、蛋白上样缓冲液均购自上海碧云天生物技术有限公司，BCA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，环指蛋白31(RNF31)抗体(ab46322)购自美国Abcam公司，GAPDH抗体、鼠抗兔二抗均购自杭州开泰生物技术有限公司，ECL化学发光液购自上海圣尔生物科技有限公司，CCK-8溶液购自上海翊圣生物科技有限公司，结晶紫溶液购自上海铭博生物科技有限公司。细胞培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司，分光光度计购自美国Thermo公司，化学发光仪购自美国Bio-Rad公司，酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 SKOV3细胞miRNA-378过表达质粒转染 SKOV3细胞培养于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)，HEK-293T细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清)，置CO2体积分数5%、温度37 ℃的饱和湿度培养箱中。采用慢病毒包装系统将miRNA-378过表达质粒、空白载体质粒分别转染至对数生长期的HEK-293T细胞，6 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，48 h后收集上清液，2 000 r/min、常温离心5 min，上清液过滤后，收集miRNA-378过表达质粒与空白载体质粒的病毒悬液。RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)分别与miRNA-378过表达质粒与空白载体质粒的病毒悬液按照1∶1比例混合。培养SKOV3细胞，采用嘌呤霉素(1 μg/mL)进行miRNA-378稳转细胞系的构建。miRNA-378过表达质粒转染的SKOV3细胞作为实验组，空白载体质粒转染的SKOV3细胞作为阴性对照组，SKOV3细胞作为空白对照组。

1.3 各组SKOV3细胞miRNA-378和RNF31 mRNA检测 采用Real-time PCR技术。取对数生长期的实验组、阴性对照组、空白对照组SKOV3细胞，分别加入1 mL 的TRIzol溶液，提取细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度和纯度。取500 ng 的RNA进行反转录，产物cDNA进行Real-time PCR。miRNA-378正向引物(5′-3′)为CTCCTGACTCCAGGTCCTGT、反向引物(5′-3′)为GCCTTCTGACTCCAAGTCCA，RNF31正向引物(5′-3′)为ACCCCCTATTGAGAGAGATTGCT、反向引物(5′-3′)为TGGAGCCTGGGACAGAGG，18S rRNA正向引物(5′-3′)为GGGAGCCTGAGAAAC、反向引物(5′-3′)为GGGTCGGGAGTGGGT，β-actin正向引物(5′-3′)为CCTGGCACCCAGCACAAT、反向引物(5′-3′)为GCTGATCCACATCTGCTGGAA。以18S rRNA为内参计算miRNA-378相对表达量(2-ΔΔCt)，以β-actin为内参计算RNF31相对表达量(2-ΔΔCt)，3次独立实验后取平均值。

1.4 各组SKOV3细胞 RNF31蛋白检测 采用Western blotting。取对数生长期的实验组、阴性对照组、空白对照组SKOV3细胞，分别加入200 μL的RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液混合后沸水煮沸5 min，10% SDS-PAGE胶分离蛋白后，湿转法转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉(PBST配制)封闭；孵育RNF31蛋白一抗工作液，室温2 h后，PBST洗涤；孵育鼠抗兔HRP标记的二抗工作液，室温1 h后，PBST洗涤；ECL化学发光液进行显色反应，观察并记录蛋白条带，计算各蛋白条带的灰度值，RNF31蛋白相对表达量=RNF31蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值，3次独立实验后取平均值。

1.5 各组SKOV3细胞增殖能力检测 采用CCK-8实验。取对数生长期的实验组、阴性对照组、空白对照组SKOV3细胞，分别接种于96孔板中(5 000/孔)，每组设置6个复孔，培养过夜后，分别于0、24、48、72 h时每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培养箱中继续孵育4 h后，酶标仪450 nm处测定光密度值(OD值，以此表示细胞增殖能力)，3次独立实验后取平均值。

1.6 各组SKOV3细胞克隆形成能力检测 采用细胞克隆实验。取对数生长期的实验组、阴性对照组、空白对照组SKOV3细胞，分别接种于6孔板中(5 000/孔)，每组设置4个复孔，每3～4 d换液，培养14 d，PBS缓冲液洗涤后，10%甲醛溶液固定细胞，0.1%结晶紫溶液染色10 min，PBS缓冲液洗涤后对细胞克隆进行计数，3次独立实验后，取平均值。

2 结果

2.1 各组SKOV3细胞miRNA-378、RNF31 mRNA和RNF31蛋白相对表达量比较 实验组SKOV3细胞miRNA-378相对表达量高于空白对照组和阴性对照组，实验组SKOV3细胞RNF31 mRNA和蛋白相对表达量低于空白对照组和阴性对照组，结果详见表1。

表1 各组细胞中miRNA-378、RNF31 mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，#P<0.05。

2.2 各组SKOV3细胞OD值比较 0、24 h时，实验组、阴性对照组、空白对照组SKOV3细胞OD值相近；48、72 h时，实验组OD值低于空白对照组和阴性对照组；结果详见表2。

表2 各时间点各组细胞OD值比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与阴性对照组相比，#P<0.05。

2.3 各组SKOV3细胞克隆形成能力比较 实验组细胞克隆数目为(19.35±3.15)个，阴性对照组为(78.26±11.35)个，空白对照组为(80.45±10.75)个，见图1；实验组与阴性对照组和空白对照组相比，P均<0.01。

图1 各组细胞SKOV3克隆形成结果

3 讨论

miRNA参与调控大约30%蛋白编码基因的表达。在卵巢癌中已鉴定出多种异常表达的miRNA分子，如miRNA-494[7]、miRNA-488[8]和miRNA-152[9]等，其在细胞凋亡、增殖和侵袭迁移过程中均发挥作用。miRNA-378参与多种疾病(包括肿瘤)的形成和恶性进展过程，如miRNA-378能够抑制肠黏膜细胞凋亡，保护肠缺血再灌注损伤[10]；胶质母细胞瘤中miRNA-378表达降低，外源性增加miRNA-378，可增强胶质母细胞瘤细胞对姜黄素的敏感性[11]。

miRNA-378在不同来源的恶性肿瘤中，既能发挥促癌基因功能又能发挥抑癌基因功能，如Tan等[12]发现，miRNA-378在宫颈癌组织表达增加，且可通过直接靶向调控ATG12基因表达而促进癌细胞侵袭迁移；Li等[13]证实miRNA-378通过调节ST7L/Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌形成和恶性进展过程中发挥促癌基因功能。在结直肠癌组织中，miRNA-378表达降低，且可作为患者不良预后的预测分子[14]；Fei等[15]发现miRNA-378在胃癌组织中表达降低，并且具有抑制胃癌细胞增殖、转移以及促进胃癌细胞凋亡的作用，提示miRNA-378在结肠癌、胃癌中发挥抑癌基因功能。而关于miRNA-378在卵巢癌中的作用，目前仍存在较大争议，如Chan等[16]发现miRNA-378在宫颈癌组织和细胞中表达增加，具有促癌基因功能，且miRNA-378可以作为宫颈癌患者预后的独立预测指标。本研究采用慢病毒转染方法，增加卵巢癌SKOV3细胞中miRNA-378表达后，细胞增殖能力以及细胞克隆形成能力被明显抑制，提示miRNA-378发挥抑制卵巢癌细胞增殖的作用，miRNA-378可能发挥抑癌基因的功能。我们推测miRNA-378可靶向调节多个不同功能的基因，根据其下游靶基因的功能不同，miRNA-378可在细胞增殖、凋亡等生理过程中发挥截然不同的功能。

本研究结果显示，miRNA-378能够抑制卵巢癌SKOV3细胞RNF31 mRNA和蛋白表达，提示RNF31可能是miRNA-378下游靶基因，miRNA-378可能在转录或转录后水平调控RNF31基因表达。RNF31基因定位于染色体14q11.2，编码由1072个氨基酸残基组成的分子量为118 kD的蛋白质，RNF31蛋白属于RBR蛋白家族，是一种E3泛素连接酶[17]。在正常组织中，RNF31表达水平较低，而在肿瘤组织中RNF31水平升高[18]，提示RNF31可能参与肿瘤形成和恶性进展过程，如Zhu等[19]发现RNF31能够维持雌激素受体α(ERα)稳定，参与调节乳腺癌细胞增殖。根据本研究结果推测，miRNA-378可能通过下调RNF31基因表达，抑制卵巢癌细胞增殖。

综上所述，本研究发现，增加卵巢癌细胞中miRNA-378表达，可抑制RNF31基因表达，抑制细胞增殖及细胞克隆形成能力。提示miRNA-378可能通过抑制RNF31表达，进而抑制卵巢癌细胞增殖。后续研究将探究miRNA-378调控RNF31表达的内在机制。