miR-204在子痫前期患者胎盘组织中的表达及对滋养细胞增殖和侵袭功能影响观察

王莉，陈小菊，郑林媚

(海南省人民医院，海口570000)

子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有疾病，以孕妇妊娠20周后出现高血压、蛋白尿为主要临床特征，常并发肾、心、肝等重要脏器的损伤，是孕产妇和围生期胎儿死亡的主要原因之一[1]。胎盘浅着床和子宫螺旋动脉重塑障碍导致胎盘功能下降和胎盘低灌注，是PE的基本病理特征[2]。迄今为止PE的发病机制尚不明确。研究[3]发现滋养细胞侵袭、增殖功能的下降与胎盘浅着床和子宫螺旋动脉重铸障碍密切相关，因此许多学者认为PE是一种滋养细胞疾病。目前研究[4]发现，微小RNA(miRNA)的表达异常与PE的发生具有明显的相关性，其可以通过影响滋养细胞增殖、侵袭等生物学功能而导致PE的发生。Choi等[5]在研究中通过miRNA基因芯片检测发现miR-204在PE患者胎盘组织中的表达异常增高，提示miR-204可能参与了PE的发生发展，但作用机制尚不清楚。本研究采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对不同程度PE患者胎盘组织中的miR-204进行了检测，同期采用脂质体转染法转染miR-204模拟物至人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo，上调HTR-8/SVneo细胞中miR-204的表达，观察上调miR-204表达对滋养细胞增殖、侵袭功能的影响，并探讨其可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年1月～2017年1月在海南省人民医院住院接受剖宫产术分娩的PE患者60例，其中轻度PE患者30例、重度PE患者30例；PE的诊断标准参照“妊娠期高血压疾病诊治指南(2015)”[6]，患有心脏病、糖尿病、原发性高血压、肾病、甲状腺功能亢进等合并症的孕产妇不纳入本次研究。选择30例同期接受剖宫产术分娩的正常孕妇作对照。所有研究对象剖宫产术中胎盘娩出后5 min内，避开钙化或出血点，在胎盘母体面中央区近脐带根部剪取约1 cm×1 cm×1 cm的胎盘组织2块，处理干净血液后，置液氮速冻，-80 ℃冰箱保存备用。PE患者与正常孕妇的年龄、分娩孕周、BMI等基线资料比较，差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。

1.2 细胞与主要试剂 人正常滋养细胞HTR8/SVneo购自美国典型培养物保藏中心，在RPMI1640培养基(含10 %胎牛血清)中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度恒温箱中常规培养，待细胞长满80%左右时进行传代，取生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。TRIzol试剂和LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；miR-204模拟物(miR-204 mimics)及阴性对照NC-mimics购自上海吉玛制药公司；逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-204、U6和基质金属蛋白酶(MMP)-9、GAPDH引物由上海吉凯基因公司设计合成；一抗MMP-9、GAPDH以及HRP标记的二抗购自美国Santa Cruz公司;Transwell小室购自美国Corning Costar公司；基质胶购自美国BD公司。

1.3 胎盘组织中miR-204的检测及其靶基因预测 采用qRT-PCR检测miR-204。TRIzol试剂提取胎盘组织总RNA，样本OD260/OD280控制在1.8～2.0。用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置反应体系进行PCR反应，miR-204以U6作为内参基因。引物序列：miR-204 正向引物为5′-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3′、反向引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6 正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：94 ℃ 2 min， 94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，40 个循环。miR-204相对表达量以2-ΔΔCt表示。采用生物学信息法，查阅miRanda(http://www.microrna.org)并参阅相关文献[7,8],预测miR-204可能作用靶基因。

1.4 HTR-8/SVneo细胞的miR-204 mimics转染、miR-204和MMP-9 检测、增殖和侵袭能力观察 ①HTR-8/SVneo细胞的miR-204模拟物转染及miR-204检测：取对数生长期HTR8/SVneo细胞，按1.5×105/孔接种于6孔细胞培养板中，5% CO2、饱和湿度恒温箱中常规培养，细胞融合度达70%～80% 时将其分为miR-204 mimics组和NC-mimics组，转染前用无血清的培养基培养细胞6 h，按LipofectamineTM2000说明书操作分别将miR-204 mimics和NC-mimics转染至两组HTR8/SVneo细胞。转染后6 h更换新鲜培养基继续培养。转染后24 h，采用qRT-PCR检测细胞中miR-204(方法同上)。② HTR8/SVneo细胞增殖能力观察：采用CCK-8。收集转染后的两组HTR8/SVneo细胞，按5 000/孔的密度加入96孔板中培养，每组设3个复孔，实验设计4个检测时间点，即转染后24、48、72、96 h，参照CCK-8试剂盒说明书于各时间点每孔分别加入10 μL 的CCK-8试剂，37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育4 h后，酶标仪于450 nm波长处测定各孔的光密度(OD)值(OD值越高表示细胞增殖能力越强)。③HTR8/SVneo细胞侵袭能力观察：采用Transwell小室实验。用基质胶对Transwell的微孔膜进行铺胶，37 ℃培养箱过夜固化后，两组各取5×104个转染后24 h的细胞，用无血清培养基重悬，将重悬的单细胞悬液200 μL加入Transwell小室的上室，小室的下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基,置入培养箱继续培养24 h后取出Transwell小室，棉签轻轻擦弃小室上室的细胞，将已经穿膜并黏附于微孔膜外表面的细胞以4%多聚甲醛固定5 min，染色，显微镜下随机取5个高倍视野，计算每个视野中的细胞(穿膜细胞)数目。④ HTR8/SVneo细胞中MMP-9 mRNA和蛋白的检测：采用qRT-PCR检测两组转染后24 h细胞中的MMP-9 mRNA，与miR-204的检测步骤相同，以GAPDH为内参基因。MMP-9 正向引物为 5′- GAACCAATCTCACCGACAGG -3′、反向引物为5′- GCCACCCGAGTGTAACCATA-3′；GAPDH 正向引物为5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′、反向引物为5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。采用Western blotting检测两组转染后24 h细胞中的MMP-9蛋白：常规提取两组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每个样本取200 μL，按照标准方法进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离;将电泳产物转至PVDF膜，5 %脱脂奶粉4 ℃封闭4 h，缓冲液洗涤3遍;加入一抗MMP-9和GAPDH,室温孵育2 h，缓冲液洗涤3遍;加入二抗，室温孵育1 h，缓冲液洗涤3遍;增强发光法显影，Quality One 软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1 PE患者和正常孕妇胎盘组织中miR-204的表达比较及miR-204靶基因预测结果 PE患者和正常孕妇胎盘组织中miR-204的相对表达量分别为2.40±0.16、1.02±0.05，两者相比，P<0.01；重度PE和轻度PE患者胎盘组织中miR-204的相对表达量分别为2.84±0.19、1.96±0.13，两者相比，P<0.01。miRanda预测的miR-204作用靶基因可能是MMP-9,miR-204与MMP-9的3′UTR区存在种子序列互补的结合位点，见图1。

注：mirSVR score表示热力学稳定性大小(要求≦-0.1)，分值越低表明miRNA与mRNA二者结合稳定性越强，相应miRNA下调基因的可能性越大； PhastCons score：表示基因非翻译区在各物种中进化保守性的强弱(≧0)，其值越大保守性越好。

图1miRanda预测miR-204靶基因为MMP-9

2.2 转染后两组HTR8/SVneo细胞的miR-204表达比较 转染后 miR-204 mimics组和NC-mimics组HTR8/SVneo细胞中miR-204的相对表达量分别为14.53±1.06、1.01±0.07，两组相比，P<0.01，提示转染miR-204 mimics能明显上调HTR8/SVneo细胞miR-204的表达。

2.3 转染后两组HTR8/SVneo细胞增殖能力比较 转染后各时间点两组HTR8/SVneo细胞OD值比较见表1，提示上调miR-204表达能明显下调HTR8/SVneo细胞的增殖能力。

表1 转染后各时间点两组HTR8/SVneo细胞OD值比较

注：与NC-mimics组相比，＊P<0.01。

2.4 转染后两组HTR8/SVneo细胞侵袭能力比较 miR-204 mimics组和NC-mimics组穿膜细胞数分别为(70±13)、(130±20)个，两组相比，P<0.01，提示上调miR-204表达能明显下调HTR8/SVneo细胞的侵袭能力，见图2。

图2 NC-mimics组与miR-204 mimics组穿膜细胞

2.5 转染后两组HTR8/SVneo细胞的MMP-9 mRNA和蛋白表达比较 miR-204 mimics组和NC-mimics组HTR8/SVneo细胞的MMP-9 mRNA相对表达量分别为0.45±0.10、1.00±0.06，两组相比，P<0.01。miR-204 mimics组和NC-mimics组HTR8/SVneo细胞的MMP-9蛋白灰度值分别为0.14±0.06、0.45±0.10，两组相比，P<0.01，电泳条带见图3。上述结果提示上调miR-204表达能明显下调HTR8/SVneo细胞MMP-9 mRNA和蛋白的表达。

图3 miR-204 mimics组和NC-mimics组HTR8/SVneo细胞的MMP-9 蛋白的电泳条带

3 讨论

在正常妊娠过程中，滋养细胞侵入子宫蜕膜和子宫螺旋动脉，代替血管内皮细胞，将狭窄的弹性血管变为低阻、无弹性且扩张的子宫胎盘血管，并失去对血管活性物质的敏感性，完成子宫螺旋动脉的重塑，从而使流入绒毛间隙的血量明显增加，维持胎盘正常的功能[9]。滋养细胞正常的侵袭和增殖能力是子宫螺旋动脉成功重塑的关键。滋养细胞增殖和侵袭能力的下降，均能影响子宫螺旋动脉的重塑，造成胎盘浅着床，是PE的重要发病机制[10]。

近年来研究[5，11]表明，PE患者胎盘组织及外周血中存在着大量异常表达的miRNA，影响滋养细胞的增殖、侵袭等生物学功能，与子痫前期的发生进展密切相关[12]。Xiao等[13]研究发现miR-144在PE患者胎盘组织中表达降低，造成滋养细胞的增殖和侵袭能力降低,可能与PE的发病有关。Xie等[14]报道miR-519d通过影响滋养细胞的增殖、侵袭和迁移能力而参与PE的发生发展。Wang等[15]发现PE患者胎盘组织中miR-20a表达升高，抑制FOXA1的表达，进而抑制滋养细胞的增殖与侵袭能力。miR-204是miRNA家族重要成员之一，定位于人类第9号染色体,在许多恶性肿瘤中表达异常,在调控细胞增殖、迁移及侵袭等过程中起着重要的作用[16]。近期miRNA基因芯片检测发现miR-204在PE胎盘组织中高表达[5]，在PE患者的血浆中也发现miR-204表达明显升高[17],提示miR-204可能参与了PE的发生发展，但具体作用机制尚不明确。在本研究中，我们通过qRT-PCR检测发现，PE患者胎盘组织中miR-204的表达显著高于正常孕妇，且重度PE患者胎盘组织中miR-204的表达显著高于轻度PE患者，提示PE患者胎盘组织中miR-204异常高表达与PE的发生发展密切相关。

研究[18]发现，滋养细胞的增殖、迁移、侵袭特性和逃避免疫系统的能力与癌细胞极其相似，而miR-204在调控癌细胞增殖及侵袭方面的作用已被广泛证实[19～21]。为了研究miR-204是否也能通过影响滋养细胞的增殖、侵袭等细胞功能参与PE的发生发展，我们通过脂质体转染技术上调人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo中miR-204的表达，模拟PE患者滋养细胞中miR-204的高表达状态，分别检测细胞的增殖和侵袭能力，结果发现高表达miR-204的滋养细胞增殖和侵袭能力明显下降。这一结果更好地阐明了高表达miR-204导致滋养细胞增殖、侵袭等细胞功能不足，最终导致了PE的发生。

miR-204调控滋养细胞功能的下游分子通路尚不明确。我们应用生物学信息法并结合基因的功能分析，预测miR-204的可能作用靶基因是MMP-9,因为miR-204与MMP-9的3′UTR区存在种子序列互补的结合位点。miR-204在视网膜母细胞瘤[22]和恶性黑色素瘤[8]中可以通过靶向调控MMP-9进而调控肿瘤细胞的增殖、侵袭等生物学行为。为了验证miR-204是否也通过调控MMP-9影响滋养细胞增殖、侵袭等细胞功能，我们通过qRT-PCR 和Western blotting检测发现，高表达miR-204的滋养细胞MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平明显下降，提示miR-204在PE发生发展中的作用与其对MMP-9基因的靶向调控有关。MMP是一类含有锌原子结合位点的蛋白水解酶家族,能够对细胞外基质中多种成分进行降解。MMP-9是MMP家族分子量最大的明胶酶，能够水解弹力纤维和V型胶原，分解细胞基质膜，在滋养细胞植入中发挥着重要作用[23]。有研究[23～25]已经证实胎盘组织中MMP-9水平的下降与PE的发生发展密切相关。敲除MMP-9基因的大鼠会出现胎盘植入困难，进而出现PE的表现[26]。抑制MMP-9活性可以明显降低滋养细胞的增殖及侵袭等细胞学功能[27,28]。

综上所述， miR-204在PE胎盘组织中表达明显增加。高表达miR-204能够通过调控MMP-9的表达使滋养细胞增殖和侵袭能力下降，与PE的发病有关。本研究结果为探明PE的发病机制和寻找有效治疗方法提供了新的思路。