副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用

梁 乔，杨本勇，石 霖，李井春，张 健，赵凤菊⋆

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁 沈阳 110164）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是常规猪上呼吸道的共存菌，在特定条件下，能够引起纤维素性心包炎、脑膜炎、急性败血症等疾病[1-2]。该菌主要的感染对象是断奶前后仔猪和保育猪，具有较高的发病率和死亡率[3-4]。呼吸道疾病的危害性日趋显著，尤其是引起的多发性浆膜炎、关节炎等危害性疾病严重影响养殖业的发展[5]，因此，早期检测尤为重要，本试验通过对副猪嗜血杆菌的保守基因infB序列设计引物，建立了该病原菌的PCR检测方法，为该病的防控和研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 副猪嗜血杆菌由沈阳农业大学惠赠，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、奇异变性杆菌、猪链球菌由辽宁省动物疫病预防控制中心保存。

1.1.2 主要试剂DNAzol购自invitrogen公司；EX Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L)、溴化乙锭、DL 2000 DNA Marker、三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液购自宝生物工程（大连）有限公司；犊牛血清购自澳洲Gibico；TSA购自北京奥博星公司；辅酶I（NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 引物 根据副猪嗜血杆菌infB基因序列设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，根据GenBenk公布的国内外副猪嗜血杆菌infB基因的参考序列合成1对引物分别为：DQ781933、EF396317、HM243068、KT740926，引物序列见表1。

表1 infB基因PCR引物Table 1Design of PCR primers for HPS

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制备 取保存的副猪嗜血杆菌菌种接种于加有血清的TSA培养基上，37℃培养18～24 h后，挑选典型菌落，用灭菌生理盐水制备成0.5麦氏单位的菌悬液，按DNAzol提取试剂说明书进行DNA的提取，将提取的DNA置-20℃备用。

1.2.2 infB基因的PCR反应及条件 采用25 μL反应体系：灭菌去离子水15.375 μL；10×PCR缓冲液 2.5 μL；dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）2 μL；EX Taq DNA聚合酶0.125 μL；上、下游特异性PCR引物各1 μL；DNA 2 μL。反应条件为 ：94℃3 min，94℃30 s，49℃30 s，72℃50 s，35个循环；72℃10 min。

1.2.3 特异性试验 将副猪嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、奇异变性杆菌、猪链球菌在优化后的体系和条件下进行PCR扩增，并设立阴性对照。

1.2.4 敏感性试验 将副猪嗜血杆菌DNA进行10倍倍比稀释5个梯度后，进行扩增来检测该方法的敏感性。

1.2.5 临床应用 用本试验建立的副猪嗜血杆菌PCR检测方法对10份临床样品进行检测，同时设立阳性病料对照、无模板阴性对照，并选取6份副猪嗜血杆菌阳性样品扩增其infB序列，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，并与NCBI基因库进行序列同源性比较。

2 结果与分析

2.1 副猪嗜血杆菌PCR扩增结果 以副猪嗜血杆菌的DNA为模板，利用本试验建立的方法进行PCR检测，结果显示，PCR可扩增出目的条带，无模板阴性对照无目的条带（见图1）。

图1 副猪嗜血杆菌PCR扩增结果Fig.1PCR amplification results of Haemophilus accessory swine Haemophilus

图2 PCR扩增结果及退火温度的优化Fig.2PCR amplification results and Optimization of annealing temperature

2.2 PCR扩增结果及退火温度的优化 对PCR退火温度进行优化，结果显示，不同退火温度对扩增结果影响不大，最终选择49℃作为PCR最佳退火温度（见图2）。

2.3 特异性试验结果 按照优化后的反应体系和反应条件对副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、猪链球菌及阴性对照进行特异性试验。结果显示，均未扩增出条带，而副猪嗜血杆菌可见清晰的目的条带（见图3）。

图3 特异性试验结果Fig.3 The specificity test results

2.4 敏感性试验结果 采用优化后的条件进行扩增，结果显示，敏感性达到10-6倍稀释度，最低检出量分别为18.1×10-6μg/mL（见图4）。

图4 敏感性试验结果Fig.4The sensitivity test results

2.5 部分临床样品检测结果 应用建立的方法对10份临床样品疑似病料进行检测，6份为副猪嗜血杆菌阳性，4份为副猪嗜血杆菌阴性。阳性扩增产物经测序后与GenBank中收录的副猪嗜血杆菌infB基因参考序列进行比较，结果显示，6份阳性样品经测序比对后的基因序列核苷酸同源性为98.2%～99%范围内，说明该方法能准确地检测出病料中的副猪嗜血杆菌。

图5 部分临床样品检测结果Fig.5Test results of some clinical samples

3 讨论

本试验建立的副猪嗜血杆菌PCR检测方法能够扩增出与预期片段大小一致的目的基因条带，且对其他5种细菌均无扩增反应发生，表明建立的PCR方法具有较高的特异性。通过敏感性试验发现在菌悬液浓度为18.1×10-6μg/mL时，能够扩增出清晰的目的条带，说明该方法具有较好的敏感性，通过临床样品的检测，说明该方法能用于检测临床病料的检测。

副猪嗜血杆菌作为一种呼吸道传染病严重危害养猪业，也成为世界范围内导致保育仔猪死亡的一种典型的细菌性疾病，能够引起猪的全身性感染，如多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、支气管肺炎等[6]。副猪嗜血杆菌病常常与猪繁殖呼吸综合征、圆环病毒病等免疫抑制性疾病发生混合感染，单纯靠临床症状无法确诊该病[7]。传统的细菌分离鉴定存在耗时长、不易于保存等特点[8-10]，本试验建立的PCR的检测方法不仅为副猪嗜血杆菌病的诊断提供的技术支撑，也为多发性浆膜炎、传染性胸膜肺炎等的有效防控提供了理论依据。