整合素BmIntegrin β2的结构分析及其对家蚕血细胞的调控作用

赵二虎，张奎，苏晶晶，潘光照，李重阳，申利，杨丽群，崔红娟

1西南大学生物技术学院 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716

2 重庆市蚕丝生物材料与再生医学工程技术研究中心，重庆 400716

3 西南大学肿瘤生物医学与转化工程研究中心，重庆 400715

4 威斯腾生物医药科技有限责任公司，重庆 400039

整合素蛋白家族(Integrin family) 是一类广泛分布于细胞表面的黏附分子受体，是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜蛋白[1-2]。整合素(或称整合蛋白) 参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质(Extracellular matrix，ECM) 之间以及细胞与病原体之间的相互作用，是细胞内外信号转导的中间桥梁，广泛参与细胞识别、细胞增殖分化、迁移侵袭和细胞衰老等一系列生理或病理过程[2-9]。目前在哺乳动物的整合素家族中，已发现有18种α亚基和8种β亚基，能组成至少24种功能性的二聚体跨膜蛋白[10-12]；果蝇的整合素家族则有5个α亚基，分别为αPS1(编码mew 基因)、αPS2(编码 if 基因)、αPS3(编码scb基因)、αPS4和 αPS5；2个 β亚基，分别为βPS(编码 mys基因) 和 βv[13-14]；果蝇整合素基因与果蝇的胚胎发育、肌肉收缩、肠道的形态发生以及细胞与细胞外基质间交流都有重要的作用[15-16]。

在鳞翅目昆虫大豆尺夜蛾Pseudoplusiaincludens和烟草天蛾Manduca sexta中，已经发现至少3个α亚基和1个β亚基，其整合素与昆虫免疫反应相关，主要是参与病原的吞噬、形成结节和包被等[12,17-19]。而鳞翅目害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和烟夜蛾Helicoverpa assulta的整合素Integrin β相关基因已经被鉴定，并分别命名为SeINT和HaITGb1，其功能不仅与昆虫细胞内免疫反应有关，还参与了其幼虫的生长发育[12,20]；此外，SeINT基因还对昆虫中肠的消化和吸收有着重要作用[21]。Zhang等和孙亚兰对家蚕整合素BmIntegrin基因家族进行了初步的描述和鉴定，研究结果显示家蚕整合素蛋白拥有6个α亚基和5个β亚基[22-23]。尽管如此，有关家蚕整合素的结构功能只有少量报道[22]，而对于家蚕整合素β亚基蛋白的研究更是少之又少。因此，笔者采用生物信息学分析及RACE技术，克隆并鉴定BmIntegrin β2基因，尝试构建 BmIntegrin β2蛋白原核表达载体，表达靶标蛋白，制备多克隆抗体，并分析其在家蚕血液免疫中的功能，为进一步研究家蚕整合素β亚基蛋白家族的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究主要采用中国本地家蚕品种大造作为实验对象，由西南大学家蚕基因资源库提供。质粒抽提试剂盒购自德国 Qiagen公司。感受态细胞由TaKaRa的感受态制备试剂盒制备。各种限制性内切酶、PCR酶、T4 DNA连接酶、载体质粒和DNA Marker等均购自大连TaKaRa公司。TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自美国 Promega公司。SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒购自美国Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA合成

选取4龄3天和5龄3天的家蚕幼虫，解剖获得家蚕体壁组织、马氏管、头部、丝腺组织、精巢、卵巢、脂肪体、中肠组织、血细胞、翅原基等组织，在液氮中研碎，然后加入TRIzol试剂，并提取各组织的总RNA；然后按照Promega逆转录试剂盒的方法步骤反转录合成各组织的cDNA。

1.2.2 BmIntegrin β2基因全长序列的获取

根据之前的文献报道[24-25]，设计基因特异RACE引物 GSP1、NGSP1、GSP2、NGSP2(引物序列见表1)。根据RACE cDNA 扩增试剂盒的说明书，进行5′和3′的RACE cDNA扩增。然后将PCR产物进行电泳检测并回收进行克隆和转化，然后筛选出阳性克隆。最后，将阳性克隆送至生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序，分析拼接后得到目的基因的cDNA全长序列。

1.2.3 BmIntegrin β2的生物信息学分析

相关基因的序列均来自于NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 或家蚕基因组数据库SilkDB(http://www.silkdb.org)，并利用在线软件SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)、NCBI保守结构域预测中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 等网站及 GeneDoc和Adobe Illustrator CS6等软件进行生物信息学分析及作图。

1.2.4 BmIntegrin β2基因的定量表达分析

基于家蚕基因组数据库，设计和合成BmIntegrin β2的荧光定量 PCR引物(表 1)，以前期获得的4龄3天和5龄3天的家蚕幼虫各组织cDNA为模板，以家蚕细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH为内参基因，进行实时荧光定量PCR扩增分析。每个组织样品分别进行3次重复试验，收集目的基因和内参基因的Ct值进行统计学数据分析；以家蚕血细胞中BmIntegrinβ2的表达量为对照，利用 2–ΔΔCt方法计算和分析其他组织中BmIntegrin β2的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 BmIntegrin β2蛋白的原核表达纯化与抗体制备

通过对基因的生物学分析，选取家蚕整合素BmIntegrin β2基因的特异性片段，然后进行PCR扩增并将扩增产物连接到 pET32a空载体中，获得pET32a-BmIntegrin β2质粒。筛选获得阳性克隆质粒后，转化到感受态细胞Rosseta 菌株中，挑取阳性的 pET32a-BmIntegrin β2/Rosetta单菌落进行培养。根据文献[26-27]中的方法，向菌液中加入1 mmol/L的IPTG，分别在16 ℃、25 ℃和37 ℃的条件下，以300 r/min的转速进行菌液培养，其中 37 ℃组培养 5 h，25 ℃组培养 12 h，16 ℃组培养24 h。裂解诱导好的菌液，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色进行拍照分析。

通过大量诱导pET32a-BmIntegrin β2/Rosetta菌表达目的蛋白，按照文献[27]所用的Triton X-100法提取和洗涤包涵体蛋白，然后用镍离子亲和柱进行纯化，并用含有相应浓度的咪唑平衡液洗脱目的蛋白；收集洗脱液进行SDS-PAGE实验分析蛋白纯化的情况。然后选取纯度高于85%的蛋白样品送至重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司，制备多克隆抗体。

1.2.6 BmIntegrin β2抗体的效价及其对家蚕血细胞的影响

采用间接ELISA法对所获得抗BmIntegrin β2血清，进行抗体效价的检测。第一步，首先在96孔酶标板中加入100 μL的抗原浓度为2 μg/L的包被液，密封置于 2–8 ℃环境过夜；将包被好的酶标板取出揭开，并去除上清液，再用洗涤液洗3次。第二步，按照上面的类似的步骤再用封闭液37 ℃封闭1 h，并用洗涤液洗3次。第三步，将相应的抗体分别以1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000和1∶256 000等比例分别稀释后，再各取100 μL加入封闭后的酶标板，置于37 ℃环境孵育1 h，并用洗涤液洗3次；以未稀释的阴性血清作阴性对照，以相应的阴性血清稀释液作空白对照。第四步，用稀释液以1∶30 000比例稀释酶标二抗，然后每孔各加100 μL的酶标二抗稀释液，将酶标板置于37 ℃环境孵育1 h，并用洗涤液洗 3次。第五步，按照 TMB显色试剂盒的步骤进行显色，并测定出450 nm处的OD值。第六步，按照以上步骤将所获得的抗体在1周内反复进行3次重复试验，利用SPSS 19.0等软件计算和分析出OD值结果的变异系数。

参照之前文献[28]的方法，先将抗体制备成5、10、20和100倍稀释液；然后从5龄3天幼虫的足部收集家蚕血细胞，将血细胞加入已配制好的梯度抗体稀释液中，约 106个/mL，置于 4 ℃环境轻摇30 min。将孵育好的细胞滴入24孔板中，25 ℃培养30 min。最后用4%多聚甲醛室温固定15 min，洗涤后置于显微镜下观察和拍照，统计分析浆细胞的数目。

2 结果与分析

2.1 家蚕整合素BmIntegrin β2基因的克隆与分析

通过前期生物信息学分析预测的结果，结合PCR技术，克隆了家蚕整合素BmIntegrin β2基因的部分cDNA序列，约为1 700 bp(图1A)；以已知的部分 cDNA序列为模板，利用 RACE技术对该基因的5′端和3′端进行扩增，并分别获得了 5′ RACE和3′ RACE的PCR片段产物(图1A)。家蚕整合素BmIntegrin β2基因在家蚕基因组数据库中被编号为BGIBMGA006002，定位于家蚕4号染色体，基因全长为6 311 bp，由8个外显子和7个内含子构成(图1B)。家蚕BmIntegrin β2基因的cDNA全长2 434 bp，其中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF) 的长度为 2 244 bp，5′端和3′端非编码区分别为118 bp和72 bp(图1C)。

图1 家蚕BmIntegrin β2全长克隆及信息分析Fig.1 Cloning and bioinformatics of BmIntegrin β2 in Bombyx mori.(A) Full-length cDNA was cloned by RACE method.M: marker; 1: PCR product of partial fragment; 2: 5′ RACE PCR product; 3: 3′ RACE PCR product.(B)The diagram of BmIntegrin β2 complete genomic sequence.(C) The diagram of BmIntegrin β2 complete cDNA sequence.

2.2 家蚕整合素BmIntegrin β2的结构分析

家蚕整合素BmIntegrin β2蛋白包含747个氨基酸(Amino acid，aa)，预测蛋白分子量为84.42 kDa，等电点为 5.349。利用 SMART和SignalP等生物信息学软件分析，发现在该蛋白的前 19个氨基酸组成一段信号肽区域，第28–435位氨基酸区域为INB结构域(Integrin beta subunits domain，INB)，第 133–137位氨基酸区域为MIDAS金属离子结合序列(Metal ion-adhesion motif，MIDAS)，第 460–502位氨基酸区域和第507–534位氨基酸区域构成了EGF结构域(Epithelial growth factor domain，EGF)，第 678–700 位氨基酸区域为跨膜区域(Transmembrane domain，TM)，第 701–746位氨基酸区域为较短的胞内域(Cytoplasmic domain，CD)(图 2A)。总之，家蚕整合素 BmIntegrin β2预测的结构主要包括信号肽、一段较大的胞外域(Extracellular domain，ED)，单次跨膜结构和较短的胞内域(图2B)。

2.3 家蚕整合素BmIntegrin β2的表达分析

对4龄3天的家蚕幼虫各组织BmIntegrin β2基因的mRNA水平进行了分析，结果显示BmIntegrin β2在家蚕血液细胞和翅原基中高度表达，在头部、马氏管和中肠组织中则有少量的表达，而在其他组织中几乎不表达(图3A)。同样的，在5龄3天的家蚕幼虫中，BmIntegrin β2在家蚕血液细胞和翅原基中依旧高度表达(图3B)。由于翅原基中包含家蚕的造血器官，因此我们推测BmIntegrin β2基因在家蚕血液细胞中可能发挥着重要的作用。

2.4 BmIntegrin β2蛋白的诱导表达及抗体制备

首先构建好带有BmIntegrin β2片段(图4A)的 pET32a-Integrin β2重组质粒(图 4B)，并将该质粒转入大肠杆菌中；然后在带有pET32a-Integrin β2重组质粒的大肠杆菌中加入 1 mmol/L的IPTG，并分别在16 ℃、25 ℃和37 ℃条件下进行重组蛋白的诱导表达。然后利用SDS-PAGE进行检测，结果显示无论是16 ℃、25 ℃或37 ℃条件下诱导相应的时间，细胞裂解后上清液中几乎没有检测到目的蛋白(图 4C，泳道 3、5和 7)，而在所有的沉淀中都检测到了约 48 kDa的目的蛋白(图 4C，泳道 4、6和 8)；与其他条件相比，在 37 ℃下目的蛋白表达量更高，这说明此条件下，Integrin更容易形成包涵体。因此，我们选择在37 ℃条件下，加入1 mmol/L的IPTG进行大规模表达 Integrin蛋白。大规模诱导蛋白后，通过Ni2+离子亲和层析法，得到纯度超过95%的家蚕整合素 Integrin β2 蛋白(图 4D)。

图2 家蚕整合素BmIntegrin β2的蛋白结构预测Fig.2 Protein structure prediction from BmIntegrin β2 sequence.(A) Nucleotide(above) and deduced amino acid sequences(below) of BmIntegrin β2 in silkworm,Bombyx mori.Pink box: siganl Peptide; gray box: integrin beta subunits domain,INB domain; red underline: antigenic peptide fragments of BmIntegrin β2; green box: epithelial growth factor domain,EGF domain; blue box: transmembrane domain; Purple box: cytoplasmic domain; yellow Wireframe: metal ion-adhesion motif,MIDAS motif; red Wireframe: polyadenylation signal.The start codon and stop codon are marked red.(B) Conserved domains of BmIntegrin β2 in silkworm,Bombyx mori.SP: signal peptide; ED:N-terminal portion of extracellular region; TM: transmembrane segment; CD: cytoplasmic domain.

图3 家蚕整合素BmIntegrin β2在家蚕幼虫时期的各组织表达图谱Fig.3 Expression of BmIntegrin β2 mRNA in the different tissues.(A) The expression of BmIntegrin β2 mRNA in the different tissues of the 3rd day of 4th larvae.(B) The expression of BmIntegrin β2 mRNA in the different tissues of 3rd day of 5th larvae.1: hemocyte; 2: wing disc; 3: head; 4: epidermis; 5: fat body; 6: malpighian tubules; 7: silk gland; 8:midgut; 9: testis; 10: ovary.

图4 BmIntegrin β2蛋白的诱导表达与纯化Fig.4 Induction and purification of recombinant protein BmIntegrin β2.(A) Protein structure prediction from BmIntegrin β2.Red Wireframe: the antibody fragment.(B) The construction of the pET32a-Integrin β2 plasmid.M:DNA marker; 1: the PCR product of antibody fragment sequence; 2–3: the plasmid/Dual restriction enzyme digestion analysis of pMD19-BmIntegrin β2; 4: extraction of PCR product; 5: pET32a vector; 6–7: the plasmid/Dual restriction enzyme digestion analysis of pET32a-Integrin β2; 8–9: single restriction enzyme digestion analysis of pET32a vector/pET32a-Integrin β2.(C) Induction of the BmIntegrin β2 protein in E.coli.M: protein marker; 1–2: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 0 mmol/L IPTG at 16 ℃ for 24 h; 3–4: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 16 ℃ for 24 h; 5–6: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 12 h; 7–8: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 5 h.(D) Purified BmIntegrin β2 protein.M: protein marker; 1–2: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 5 h; 3: the soluble fraction before/after purification.

2.5 BmIntegrin β2的抗体效价及其对家蚕血细胞的调控作用

我们所设计的BmIntegrin β2重组蛋白抗原片段的氨基酸序列总长为 235个氨基酸(图 2A和4A)；具体为 BmIntegrin β2 蛋白的第 20–254 位氨基酸，其中包括完整的 MIDAS金属离子结合序列和部分的INB结构域(图2A和4A)。我们采用间接ELISA法，对所获得的BmIntegrin β2抗体进行了抗体效价的检测，结果显示BmIntegrin β2抗体效价高达 1∶128 000(表 2)，这说明所获得 BmIntegrin β2抗体具有较高的抗体效价。另外，所有稀释度的样品的变异系数在 0.929%–8.166%之间(表 2)，这也说明所获得BmIntegrin β2抗体的重复性和稳定性均良好。因此，BmIntegrin β2抗体可为后续研究BmIntegrin β2蛋白功能提供抗体支持。

为了研究BmIntegrinβ2蛋白在家蚕血液免疫中的作用，我们通过采集家蚕的血液，在体外用稀释5倍后的抗BmIntegrin β2血清对家蚕的循环血细胞进行孵育，如图5A所示，经抗BmIntegrin β2血清孵育过的循环血细胞中浆细胞的数量明显减少，这从侧面说明BmIntegrin β2抗体可能抑制了浆细胞的延伸性和粘附能力。为了证实这一结果，我们将抗BmIntegrin β2血清进行5–100倍的稀释后继续检测其对浆细胞数量的影响，结果发现随着抗体浓度的逐步提高，浆细胞的数量越来越少，呈现出显著的剂量依赖效应。这也进一步表明BmIntegrin β2可能参与对浆细胞的延伸性和粘附能力的调控，进而影响到家蚕血液的免疫反应。

表2 家蚕整合素BmIntegrin β2抗血清的效价检测Table 2 Titer curve of anti-BmIntegrin β2 serum

图5 BmIntegrin β2抗体对浆细胞数量的影响Fig.5 Effect of anti-BmIntegrin β2 serum on the plasmatocytes number.(A) The analysis of the plasmatocytes number after treated by pre-immune serum and anti-BmIntegrin β2 serum.Anti-BmIntegrin β2 serum was diluted to 5-Fold and cells marked with “ * ” are plasmatocytes.(B) Effects of gradient dilution anti-BmIntegrin β2 serum on the number of plasmatocytes.Data represent the ±s of at least three independent experiments.Statistical analysis was performed using the 2-tailed Student’s t-test,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 讨论

昆虫的血液系统为开放式循环系统，体腔内的所有组织器官均浸浴其中，昆虫的血液系统不仅具有运输营养物质和代谢废物的能力，还具有细胞免疫调节的功能。因此，昆虫血细胞在先天性免疫反应中发挥重要的作用，如吞噬作用、包囊作用、结节作用、黑化反应和抗菌肽分泌等[23,29]。传统的昆虫血细胞分类方法，主要是根据组织化学染色、细胞形态和功能特征等对血细胞进行区分，据此家蚕血细胞可分为 5种类型，即原血细胞(Prohemocyte)、颗粒细胞(Granulocytes)、浆细胞(Plasmatocytes)、拟绛色细胞(Oenocytoids) 和小球细胞(Spherulocytes)[30-32]。在家蚕的血细胞类型中，颗粒细胞和浆细胞是执行细胞免疫反应的主要血细胞类型，其中家蚕浆细胞体积相对较大，均大于其他类型的血细胞，仅稍小于拟绛色细胞，但拟绛色细胞没有粘附能力；此外浆细胞还拥有非对称性伪足(Pseudopod)，这也是浆细胞区别其他类型血细胞的主要特征之一[30-31,33]。浆细胞主要参与家蚕血液免疫中的包囊反应，其可通过伸出非对称性伪足快速粘附到外源入侵物或创伤的表面进行免疫反应[33]。

整合素是一类广泛分布于细胞表面的黏附分子受体，是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜蛋白[1-2]。整合素参与细胞与细胞、细胞和细胞外基质(Extracellular matrix，ECM) 之间以及细胞与病原体之间的相互作用，其是细胞内外信号转导的中间桥梁，广泛参与细胞识别，细胞增殖分化、迁移侵袭和细胞衰老等一系列生理或病理过程[2-9]。在鳞翅目昆虫细胞内，例如甜菜夜蛾Spodoptera exigua和烟夜蛾Helicoverpa assulta等，整合素主要表达于血细胞，参与其细胞内免疫反应。有关家蚕整合素的功能作用的报道相对较少，我们实验室曾经对家蚕整合素基因Integrin αPS3[25]和 Integrin β1[34]进行了研究，发现其均高表达于家蚕循环血液细胞，且都参与了家蚕血细胞执行的免疫反应过程。本研究中的 BmIntegrin β2蛋白，同样地属于跨膜糖蛋白整合素家族，也高表达于家蚕循环血液细胞。我们通过BmIntegrin β2蛋白结构分析发现其蛋白结构中胞外域占据了很大的部分，因而采用胞外域氨基酸的序列来制备BmIntegrin β2抗体。根据最终实验数据的分析结果，我们推测BmIntegrin β2抗体可能通过与BmIntegrin β2蛋白胞外域部分结合，竞争性地抑制了其与整合素配体的结合，从而阻断整合素信号转导的桥梁作用，最终抑制了浆细胞的延伸性和粘附作用。目前家蚕整合素BmIntegrin β2在家蚕血液细胞免疫反应中具体的作用机制还不清楚，但本研究获得的纯化的BmIntegrin β2抗体及所发现其对浆细胞粘附能力的影响，为进一步研究BmIntegrin β2在昆虫细胞中的功能作用奠定了基础，并提供了一个新的研究视野。