1-MCP处理对采后葡萄果梗褐变及叶绿素降解相关基因的影响

李具鹏,傅茂润,杨晓颖

(齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院,山东济南 250353)

葡萄(VitisviniferaL.)果梗的品质对消费者偏好和市场价格有显著的影响。果梗褐变降低了采后葡萄的品质,这是影响鲜食葡萄品质的非常重要的问题[1]。Crisosto等[2]研究表明,褐变的主要原因与失水有关。Lichter等[3]研究表明,水分损失尽管非常重要,但并不是褐变的唯一因素。许文平[4]研究发现,1-MCP抑制了跃变型果实果肉组织多酚氧化酶(PPO)活性的增加和减缓总酚含量的下降,减轻了果肉组织的褐变程度。盛蕾[5]也发现,在南国梨果皮褐变期间,PPO活性显著升高,总酚含量显著下降,并且与膜脂代谢的相关基因PuPLD和PuLOX的表达水平显著上调。Li等[6]研究表明,1-MCP处理可延迟葡萄梗的褐变。但对果梗褐变的分子机理研究鲜有报道,本文旨在从叶绿素降解途径讨论1-MCP延迟葡萄果梗褐变的分子机理。

1-MCP是一种乙烯效应抑制剂,广泛用于水果保鲜。Hershkovitz等[7]研究表明,低浓度1-MCP处理能降低鳄梨叶绿素的降解,抑制叶绿素酶的活性,降低与果皮变色相关的多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的活性。Luo等[8]研究发现,1-MCP处理有利于保持梅果实可溶性固形物与可滴定酸度的含量,并且抑制了叶绿素酶活性,延缓了叶绿素的分解,延长了梅的货架期。吴小华等[10]研究发现,1-MCP处理能显著抑制黄冠梨常温贮藏期间果心褐变的发生,但其分子机制尚未阐述。

叶绿素的降解途径已在叶片的衰老过程得到阐述,是一个多补酶促反应[11]。首先,叶绿素b在叶绿素b还原酶(NYC1)、NOL(NYC1-like)及7-羟甲基叶绿素还原酶(HCAR)作用下转化为叶绿素a;其次,叶绿素a脱去Mg2+,在脱镁叶绿素水解酶(PPH)作用下生成脱镁叶绿酸a;然后,脱镁叶绿酸a通过脱镁叶绿酸氧化酶(PAO)进一步分解,通过红色叶绿素代谢产物还原酶(RCCR)生成初级荧光叶绿素代谢产物(pFCC),期间有保绿基因(SGR1)参与反应;最后pFCC转化为线性四吡咯产品存储在衰老细胞的液泡内。本实验选取上述参与叶绿素降解途径的基因进行相对表达量的分析,以探究1-MCP对葡萄梗具有保绿作用的分子机制。

巨峰葡萄是鲜食葡萄中重要的商业品种,采后贮藏中其果梗很容易发生褐变[9]。本研究的目的是探讨1-MCP和乙烯对葡萄果梗品质、叶绿体超微结构与叶绿素降解途径相关基因的影响。测定了呼吸速率、可溶性糖含量、水分含量、褐变指数、色差和叶绿素含量,以及通过透射电镜观察了叶绿体超微结构。同时,利用定量RT-PCR分析了叶绿素分解的分子机制及其对褐变的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“巨峰”葡萄(V.viniferacv. Kyoho) 采摘于济南市长清区葡萄园;酚酞指示剂、氢氧化钠、草酸、2,6-二氯靛酚、丙酮、3,5-二硝基水杨酸等试剂,次氯酸钠(NaClO)溶液(有效氯含量≥10%)等 均为分析纯(AR),济南力戈科技有限公司。

FLY-YS-828L型恒温保鲜柜 北京福意电器有限公司;YP-20002型电子天平 金诺天平仪器有限公司;WSC-S型色差计 上海海精科物理光学仪器厂;TGL16型台式低温冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司;V1100D型可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;荧光定量PCR仪(FQD-96A) 杭州博日科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 挑选成熟度一致,无损伤、无腐烂的果实,用1%的次氯酸钠消毒2 min晾干后备用。预试验结果表明1-MCP处理有利于保持葡萄果梗的品质,延缓褐变程度。本实验继续采用预实验的处理条件进行三个处理:1.0 μL/L 1-MCP处理,100 μL/L乙烯处理,空白对照。将各处理葡萄分别置于0.1立方米的密封塑料容器内熏蒸,处理温度(10±2) ℃,熏蒸时间为24 h,每组处理放置6串葡萄。将各处理好的葡萄分别放入塑料筐内,再放进PE保鲜袋(厚0.03 mm)后扎紧袋口,于保鲜柜(10±2) ℃中贮藏,每2 d观察测定相关指标,贮藏时间为8 d。每个处理重复3次。

1.2.2 呼吸强度与可溶性糖含量测定 呼吸强度参照杨振生[12]的静置法。结果以CO2mL·kg-1·h-1表示。可溶性糖含量的测定使用蒽铜法测定[13]。每个处理测定三次重复。

1.2.3 果梗褐变指数的测定 参照Champa等[14]方法稍作改动,将葡萄果梗的褐变面积分为4级,没有干褐的为1级,整个果梗都保持绿色;轻微干褐2级,干褐面积0～1/4,只有果梗的分支有轻微的褐变;中等干褐为3级,干褐面积1/4～3/4,果梗与次级分支有中等程度的褐变;干褐3/4以上的为4级,整个果梗与次级分支发生严重的褐变。

果梗褐变指数(%)

1.2.4 果梗组织含水率的测定 称5～10 g样品在60～70 ℃干燥2～3 h,然后在100～105 ℃烘箱中烘至恒重。

1.2.5 色差、叶绿素含量的测定 使用WSC-S型测色色差计进行色差测定。叶绿素含量的测定参照李合生[15]法。三次重复。

1.2.6 叶绿体超微结构观察 透射电镜参照徐萍[16]的方法。将贮藏8 d时不同处理的葡萄果梗切成片(0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm),立即放入含有3%戊二醛固定液(pH7.2)的瓶中,置于4 ℃冰箱固定24 h。样品经磷酸缓冲液漂洗后,转入1%锇酸中,4 ℃固定12 h。样品经冲洗、乙醇逐级脱水后,转入Epon812环氧树脂内浸透包埋。用LKB-V型超薄切片机切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅对切片双重染色后,用日产JEOL-1200EX型透射电镜观察、拍照。

1.2.7 叶绿素降解相关基因的表达分析 总RNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant试剂盒。PrimescriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第一链(购自TaKaRa公司)。采用primer premier 6.0软件进行引物设计,以Vlactin-7为内参基因。引物序列(表1)由生工生物工程(上海)公司合成。使用FQD-96A荧光定量PCR仪和SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行基因相对表达水平分析。反应程序为95 ℃ 10 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,40个循环。qRT-PCR的数据分析采用 2-ΔΔCT方法,每个处理样品设置3次重复。

表1 qRT-PCR 所用引物Table 1 Sequences of the primers used for qRT-PCR

1.3 统计分析

实验数据使用SAS 9.4进行差异显著性分析,采用Excel 2016软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗的呼吸速率和可溶性糖含量的影响

1-MCP和乙烯处理对葡萄梗呼吸速率的影响如图1所示。由图1可知,在对照中,0 d后呼吸速率大幅增加,4 d达到峰值,随后在6、8 d时急剧下降。乙烯处理增加了果梗呼吸速率,但没有改变高峰的时间。1-MCP处理后,贮藏2～4 d,呼吸速率显著低于对照组和乙烯处理组(p<0.05)。结果表明,1-MCP处理明显抑制了贮藏前期葡萄梗的呼吸速率,并发现在贮藏过程中葡萄梗出现呼吸高峰,与Li等[6]报道相似。

图1 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗呼吸速率的影响Fig.1 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on respiration rate of grape rachis

1-MCP和乙烯处理对葡萄梗可溶性糖含量的影响如图2所示。由图2可知,贮藏期间葡萄梗中可溶性糖含量呈逐渐下降的趋势。与对照和乙烯处理相比,用1-MCP处理的果梗中可溶性糖含量在4～8 d更高;贮藏8 d后,1-MCP处理比乙烯处理的可溶性糖含量高17.0%,这与1-MCP处理的果梗中的较低的呼吸速率(图1)相一致。

图2 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗可溶性糖含量的影响Fig.2 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on soluble sugar content of grape rachis

2.2 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗褐变和组织含水量的影响

1-MCP和乙烯处理对葡萄梗的保鲜效果如图3所示。由图3可知,与对照和乙烯处理相比,采用1-MCP处理的葡萄梗直至8 d仍保持健康的绿色,只在次生轴中出现褐变现象。对照和乙烯均已达到商业不可接受的程度。由图4可知,在采后贮藏期间,葡萄梗的褐变指数逐渐增加,并在贮藏后期达到最大。乙烯处理加剧了褐变,在贮藏8 d时,1-MCP处理与对照相比降低了16.7%。

图3 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗的保鲜效果Fig.3 Effect of 1-MCP and ethylenet treatments on preservation of grape rachis

图4 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗褐变指数的影响Fig.4 Effect of 1-MCP and ethylenetreatments on rachis browning of grape rachis

1-MCP和乙烯处理对葡萄梗组织含水量的影响如图5所示。由图5可知,随着贮藏时间的延长,组织含水量呈下降趋势。乙烯和对照组中组织含水量降低明显,而1-MCP处理的果梗水分损失最小。在贮藏到8 d时,与初始含水量(0 d)相比,对照和乙烯处理的果梗分别损失了10.3%、11.67%,而1-MCP处理损失了7.03%。结果表明,1-MCP处理有利于保持葡萄梗的组织含水量。

图5 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗组织含水量的影响Fig.5 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on tissue water content of grape rachis

2.3 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗色差与叶绿素含量的影响

1-MCP和乙烯处理对葡萄梗L*(图A)值和a*(图B)值的影响如图6所示。由图6可知,对照、乙烯和1-MCP处理的葡萄梗,其亮度(L*)和绿色度(-a*)存在差异。其中1.0 μL/L 1-MCP处理明显(p<0.05)抑制了-a*值的上升。在8 d时,1-MCP、对照和乙烯处理的果梗的亮度(L*)分别下降约11%、16%、21%。

图6 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗L*(A)值和a*(B)值的影响Fig.6 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on L* value(A)and a* value(B)of grape rachis

水果中颜色的变化与叶绿素含量的减少和类胡萝卜素合成的增加相关[17]。1-MCP和乙烯处理对葡萄梗叶绿素含量的影响由图7所示。由图7可知,在贮藏期间,葡萄果梗中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素a+b的含量变化呈下降趋势。在对照组中,尤其是在乙烯处理中,叶绿素含量急剧下降。在8 d时,1-MCP处理的“巨峰”葡萄梗中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量分别比对照高出18.0%、26.4%、26.5%。

图7 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗叶绿素a(A)、叶绿素b(B)、叶绿素a+b(C)含量的影响Fig.7 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on chlorophyll a(A),chlorophyll b(B),chlorophyll a+b(C)concentrations of grape rachis

2.4 1-MCP和乙烯处理对葡萄果梗叶绿体超微结构的影响

绿色组织中的叶绿体呈梭形或椭圆形,具有完整的膜系统,并且类囊体堆叠紧密且有序。1-MCP和乙烯处理对葡萄梗表皮细胞叶绿体超微结构的影响如图8所示。由图8可知,在8 d时,乙烯处理的叶绿体膜受到严重破坏,基粒分散,叶绿体基质降解分散到细胞质中。在对照中,叶绿体是肿胀形的,叶绿体膜明显受损。相反,用1-MCP处理的果梗具有结构更完整的叶绿体,其叶绿体膜完整且和基粒组织良好。由此表明,1-MCP处理延缓了“巨峰”葡萄果梗表皮组织中叶绿体的分解。

图8 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗表皮细胞叶绿体超微结构的影响Fig.8 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on chloroplast ultrastructure of grape rachis注:cm:叶绿体膜;g:叶绿体基粒;sg:淀粉粒;p:质体小球。

2.5 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗叶绿素降解途径基因表达的影响

叶绿素分解途径相关基因的表达量以对照组0 d的表达量为标准。1-MCP和乙烯处理对葡萄梗叶绿素降解相关基因表达量的影响如图9所示。由图9可知,对照组葡萄梗中,VlNYC1、VlHCAR、VlPPH、VlPAO和VlSGR1的表达量在储存期间整体呈现增加的趋势,VlNOL的表达量无显著变化(p>0.05),VlRCCR显示轻微降低,贮藏0～4 d和贮藏6～8 d之间差异显著(p<0.05)。1-MCP处理显著下调了VlNYC1、VlHCAR、VlPAO和VlSGR1基因的表达;除VlPPH的表达在2、8 d时受到抑制,1-MCP处理对VlNOL、VlRCCR和VlPPH的表达基本没有影响;除贮藏8 d外,乙烯处理显著上调了VlNYC1、VlHCAR、VlPPH、VlPAO和VlSGRl的表达(p<0.05)。结果表明,1-MCP和乙烯通过调节叶绿素分解途径相关基因的表达来影响叶绿素的分解。

图9 1-MCP和乙烯处理对葡萄梗叶绿素降解相关基因表达量的影响Fig.9 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on expression of chlorophyll breakdown pathway genes of grape rachis注:不同小写字母表示相同贮藏时间不同处理之间差异显著(p<0.05)。

3 讨论

果梗褐变是葡萄采后贮藏中出现的不利的特征,导致葡萄品质下降,商品性降低。Crisosto等[18]研究表明,防止果梗褐变的先决条件是在相对高湿度环境下贮藏以减少水分流失。然而Li等[5]研究表明,乙烯参与了果梗的褐变过程,1-MCP显著降低了贮藏期间葡萄果梗的呼吸速率,呼吸速率随着货架期的延长而降低。本研究中,与对照和乙烯相比,1.0 μL/L 1-MCP处理推迟并降低了呼吸峰值。

由果实本身释放的内源乙烯可能加速果皮中叶绿素的降解,如梨[19]、香蕉和苹果[20]。本研究中,外源乙烯加速了贮藏期间果梗褐变和叶绿素的降解。果实成熟衰老过程中,叶绿体分解形成有色体[21-22]。本文通过透射电子显微镜发现,乙烯加速了叶绿体的分解,而1-MCP有利于维持葡萄梗表皮细胞中叶绿体的完整性。PAO是叶绿素分解的关键调控因子,其表达量与叶片衰老呈正相关[23]。叶绿素b降解的第一步是转化为叶绿素a,由NYC1、NOL和HCAR催化[24]。NOL(NYC1-like)是编码与 NYC1 基因非常相似的蛋白,在体外试验中均显示出叶绿素b还原酶活性,在类囊体膜中以复合物的形式起作用[25-26]。Cheng等[27]报道,在梨果实中,1-MCP可以抑制PAO、NYC、NOL、SGR1和PPH的表达,推迟了叶绿素分解代谢途径中的下游反应,从而延缓果皮黄化期间叶绿素的降解。本研究表明,1-MCP处理抑制了果梗的褐变以及VlNYC1、VlHCAR、VlPAO和VlSGR1的表达,延缓了“巨峰”葡萄果梗中叶绿素的降解。以上表明,乙烯和1-MCP可以在细胞和分子水平上调节果梗的褐变。

4 结论

本文研究表明,“巨峰”葡萄采后果梗褐变的部分原因是叶绿体分解和叶绿素降解。1-MCP有效延迟了葡萄果梗的褐变程度、叶绿素降解和叶绿体分解,而乙烯的作用是相反的。与乙烯和对照处理的果梗相比,1-MCP处理的葡萄果梗,其与叶绿素分解相关的VlNYC1、VlPAO、VlSGR1和VlHCAR基因的表达量显著降低。1-MCP处理也降低了果梗的呼吸速率和水分流失。因此,1-MCP可应用于葡萄采后贮藏保鲜,有利于保持采后葡萄果梗的品质。