近红外光谱法快速检测梨汁中柠檬酸和L-苹果酸含量

田 晶,李巧玲

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018)

梨是我国继苹果、柑橘之后的第三大水果,但由于我国梨的优质果率较低,且大多数品种贮藏性能有限,削弱了梨果的市场竞争力,因此除一部分鲜食外,大部分是将梨加工制汁,这样既能满足广大消费者的需求又可以解决鲜梨的销售问题[1]。有机酸是果汁中主要的风味营养物质,其含量高低与果汁制品的品质有着密切关系[2]。天然果汁不仅营养丰富,而且果汁中的有机酸还可以改善人们的食欲,促进消化腺的活动,有助于食物的吸收。然而,由于水果原料和生产成本的限制,一些商家为了追求利润,通常直接将甜味剂、香精、色素、防腐剂和酸味调节剂(主要为柠檬酸)等添加剂勾兑成果汁,或向少量原果汁中加入柠檬酸等食品添加剂勾兑成果汁,以次充好,以假乱真,因此果汁掺伪检测成为国内外关注的焦点[3-6]。

梨汁中存在的有机酸主要有:苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、莽草酸、富马酸、奎宁酸、乳酸等,其中苹果酸和柠檬酸为主要有机酸[7],而果汁掺伪中的重要成分即为苹果酸和柠檬酸。由于梨果中的苹果酸主要为L-苹果酸,一般不含D-苹果酸,即使有D-苹果酸含量也非常小,因此,通过测定梨汁中L-苹果酸和柠檬酸的含量及相互比例,可以鉴别梨汁的掺假现象[2]。在所有梨汁中苹果酸的含量均大于柠檬酸的含量,即L-苹果酸和柠檬酸含量之比大于1。如果柠檬酸含量超过一定比例或有D-苹果酸存在,即可判定该梨汁中添加有外源性柠檬酸或DL型苹果酸[2]。

有机酸含量的测定方法主要有:化学滴定法、液相色谱法[8-10]、荧光法、比色法、气相色谱法、薄层色谱法等方法[11]。化学滴定法一般只用于食品中总酸的测定;后面几种方法虽然可以检测单个有机酸的含量,但是需要对样品进行预处理,存在耗时长、实验数据处理繁琐、检测程序复杂等问题[11-12]。近红外光谱分析技术不同于上述检测手段,一般通过化学计量法抽取所需要的特征信息用于对目标成分的预测,不需要对样品进行破坏、去除基体干扰等过程,因此,没有有害物质对周围环境造成的污染。该方法具有检测所需时间短、费用低、检测程序简单等优点,是一种无损产品检测的方法。

近年来,近红外光谱技术在果汁饮料中的应用多集中于对苹果汁品种、掺伪及果汁含量等方面的研究[13-21],在梨汁方面研究的较少,尤其在梨汁中具体成分的检测方面研究更少。本研究拟结合参考文献[22-26],探索用近红外光谱来检测梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的含量,为梨汁品质好坏的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜皇冠梨 河北省石家庄市北国超市;L-苹果酸、D-苹果酸和柠檬酸标准品(纯度≥99.0%) 河北省食品质量监督检验研究院;甲醇(色谱纯)、磷酸二氢钾和磷酸(分析纯) 天津康科德科技有限公司;0.45μm有机相微孔滤膜 天津市沃尔孚科技发展有限公司;实验用水 均为超纯水。

NIRSTMDA1650近红外光谱仪(配有Mosic和WinISI II软件,带有样品杯) 丹麦FOSS公司;LC-20A高效液相色谱仪(配有LC solution工作站和SPD-20A型紫外检测器) 日本岛津公司;AL204万分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;TG18G高速离心机 盐城市凯特仪器有限公司;PTD-20-3超纯水制备仪 上海力新仪器有限公司;KUDOS-SK5200LHC超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;PB-10型pH计 德国赛多利斯集团。

1.2 实验方法

1.2.1 梨原汁的制备 将购买的新鲜皇冠梨按以下工艺流程制成梨原汁[2],冷冻保存待分析测定。

原料→破碎→匀浆→离心→过滤→原汁→冷冻贮藏

操作步骤:将购买的新鲜皇冠梨清洗、去皮、去核,采用四分法取样,可食用部分破碎混匀,再打成匀浆,并用超纯水稀释至原浆的五分之一,用8000 r/min的转速对稀释后的样品进行离心,再用0.45 μm微孔滤膜过滤,将处理好的样品放入冰箱中冷冻备用。

1.2.2 梨原汁中柠檬酸和苹果酸的测定 梨原汁中柠檬酸和苹果酸的测定按参考文献[2]用高效液相色谱法检测。色谱条件为:色谱柱BOSTON GREEN ODS-AQ C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);检测波长210 nm;流动相,甲醇和磷酸二氢钾(体积比为3∶97,pH2.9);流速,0.5 mL/min;柱温,30 ℃。每个样本平行测定三次,取平均值作为测定结果。

1.2.3 梨原汁光谱数据的采集 取1.2.1中制备的梨原汁大约2 mL小心倒入近红外分析仪的样品杯中,盖上反射板。通过反复试验,光谱采集过程中仪器工作参数为:光谱扫描范围1100～1650 nm,分辨率0.2 nm,每份样品重复采谱3 次,每次扫描样品时要求重新装样,取平均反射吸光率光谱作为实验数据,试验的环境温度为25 ℃左右。

1.3 数据处理与统计分析

利用WinISI II软件对采集得到的近红外光谱图进行处理,并将一阶导数、二阶导数、多元散射校正(multiplication scatter correction,MSC)、变量标准化(standard normal variate,SNV)、去散射和SNV且去散射6种光谱预处理方法的效果进行比较。应用偏最小二乘(partial least square,PLS)法、修正的最小二乘(modified partial least square,MPLS)法和主成分回归(principle component regression,PCR)3种数学校正方法分别建立数学模型。

用模型相关系数r、定标标准偏差(standard error of calibration,SEC)和交互验证标准误差(standard error of cross validation,SECV)作为模型精度评价指标,用预测相关系数(correlation coefficient of prediction,rp)、相对分析误差(standard deviation ratio,SDR)和预测标准差(standard error of prediction,SEP)检验模型的准确度[27-29]。一般情况下,SECV和SEC值越小,r值越大,模型的精度越高。SEP和SDR值越小,rp值越大,表明模型的预测性能越好[30]。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法测定梨原汁中的柠檬酸和苹果酸

尽管对于食品中有机酸的测定有相关的标准——GB 5009.157-2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》[31],但是由于苹果酸是外消旋体,由L-苹果酸和D-苹果酸组成,国标GB 5009.157的测定方法只是对苹果酸的测定,因此,本研究者通过对测定条件进行优化,得到了柠檬酸、L-苹果酸和D-苹果酸的最优色谱分离条件,该方法的回收率为91.7%～101.9%,相对标准偏差为0.12%～1.55%[2]。图1为该条件下测定的柠檬酸和苹果酸的标准品色谱图,图2为纯梨汁色谱图。由图2可看出,纯皇冠梨汁中柠檬酸含量较少,L-苹果酸含量较多,没有检测到D-苹果酸。

图1 柠檬酸、L-苹果酸和D-苹果酸混合标准溶液色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 40 μg/mL citric acid,L-malic acid and D-malic acid standard solution注：1.L-苹果酸;2.柠檬酸;3.D-苹果酸。

图2 稀释5倍后纯梨汁的色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of pure pear juice diluted 5 times注：1.L-苹果酸;2.柠檬酸。

2.2 校正集和验证集样品的确立

取1.3.1中制备的梨原汁溶液70份。随机选出50份作校正集样品,余下20份组成独立验证集。表1为用高效液相色谱法测定的鲜皇冠梨原汁中L-苹果酸和柠檬酸的测定结果。从该测定结果可得出,在梨原汁中柠檬酸的含量比L-苹果酸低,这两者的测定值均呈正态分布,说明所选样品具有一定的代表性。

表1 校正集和验证集鲜皇冠梨原汁中L-苹果酸和柠檬酸含量统计Table 1 Statistics of citric acid and L-malic acid content in calibration set and validations set

2.3 梨原汁近红外光谱图的预处理

近红外光谱采集时受仪器、环境条件、样品背景等的影响,会出现基线漂移、光散射和噪声等现象,这些现象会干扰光谱信息与样本内有效成分的分析,为了消除这些影响,突出有用信息,常用导数处理、MSC、SNV等预处理方法。导数处理可以消除基线漂移和其它背景的干扰,提高分辨率和灵敏度[31]。SNV和MSC可以有效地消除散射影响,增强与成分含量相关的光谱吸收信息[23]。

图3A为新鲜的皇冠梨汁的近红外光谱扫描图。由图中可知在1300～1500 nm范围里包含着梨原汁的吸收信息,光谱图在1450 nm达到最大吸光度,在此吸光度的点上不同个体的梨汁样本存在着较大差异,这些差异是由于梨汁本身化学物质含量的不同等造成的。由于原始光谱图本身包含信息量过少,仪器或其它噪声对光谱图影响过大,需要对光谱进行预处理。

图3 梨原汁近红外光谱图Fig.3 NIR spectra of pure pear juice注：A：原图；B：一阶导数处理后；C：二阶导数处理后。

图3B和图3C分别为新鲜皇冠梨汁的一阶导数,二阶导数近红外光谱图。导数计算处理时采用的光谱点间隔数和平滑处理间隔点均为4,没做二次平滑处理。在一阶导数光谱图中的1360～1540 nm范围内包含的信息较为丰富,1400 nm处有明显的波谷,1490 nm处有明显的波峰。二阶导数光谱图给出的信息最为丰富,在1320～1550 nm的区间共存在三处波峰和波谷,该图与原光谱图和一阶导数光谱图有着显著的差异性,由此可看出,对原光谱图进行预处理是非常必要的。

2.4 预测模型的建立

为了建立最优梨汁中柠檬酸和L-苹果酸含量的预测模型,本研究将不同的预处理方法与不同的统计数学校正方法相结合,并对结合后建立的数学模型进行分析。表2～表4分别为不同光谱预处理的鲜皇冠梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的MPLS、PLS和PCR的模型对比。

表2 不同光谱预处理方法对鲜皇冠梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的MPLS模型精确性的影响Table 2 Influence of different spectral pretreatment methods on the accuracy of MPLS model for citric acid and L-malic acid

表3 不同光谱预处理方法对鲜皇冠梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的PLS模型精确性的影响Table 3 Influence of different spectral pretreatment methods on the accuracy of PLS model for citric acid and L-malic acid

表4 不同光谱预处理方法对鲜皇冠梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的PCR模型精确性的影响Table 4 Influence of different spectral pretreatment methods on the accuracy of PCR model for citric acid and L-malic acid

由表2～表4可以看出,对采集到的皇冠梨汁运用不同光谱预处理方法处理后,运用MPLS所建立的数学模型中柠檬酸的r最高为0.8830,L-苹果酸的r最高为0.9345;运用PLS所建立的数学模型中柠檬酸的r最高为0.9058,L-苹果酸的r最高为0.9209;运用PCR所建立的数学模型中柠檬酸的r最高为0. 8602,L-苹果酸的r最高为0.9195,由此可得出:对柠檬酸和L-苹果酸而言,运用PCR这种数学校正方法建立的数学模型的精确度均比PLS和MPLS要差一些。在对柠檬酸所有的预处理方法中,MSC预处理法的相关系数最高,其值为0.9058;二阶导数预处理法的定标标准差和交互验证标准误差最低,分别为0.0225和0.0288。但综合来看,其最适宜模型处理方法为PLS结合MSC,该模型在未经剔除异常点等优化前,其最高r为0.9058,SEC和SECV分别为0.0301和0.0298,基本符合建立近红外模型需要。在对L-苹果酸的所有的预处理方法中,SNV去散射的预处理方法的相关系数最高,其值为0.9345;去散射预处理法的定标标准差和交互验证标准误差最低,分别为0.0924和0.0351。其最适宜模型处理方法为MPLS结合SNV去散射,该模型在未经剔除异常点等优化前,其最高相关系数为0.9345,SEC和SECV分别为0.2003和0.2856,适合建立近红外模型。整体而言,L-苹果酸的模型处理方法的精确度均优于柠檬酸,这可能与柠檬酸在梨原汁中的含量较少,在用高效液相色谱法对其测定时相对标准偏差较大[2]等因素有关。

根据表2～表4中得到的最优模型结果,进一步在剔除异常点后对L-苹果酸和柠檬酸的最优模型进行评价。图4和图5分别为鲜皇冠梨汁中L-苹果酸和柠檬酸建模效果和优化后的关系图,从图中可以看出,原梨汁中L-苹果酸和柠檬酸测量值在剔除异常点后线性关系均明显提高。

图4 L-苹果酸测量值与预测值之间的关系Fig.4 Linear relationship between measured value and prediction value of L-malic acid in MPLS model注：A：未剔除异常点；B：剔除异常点后。

图5 柠檬酸测量值与预测值之间的关系Fig.5 Linear relationship between measured value and prediction value of citric acid in PLS model注：A：未剔除异常点；B：剔除异常点后。

L-苹果酸经过优化后的最优模型的相关系数可达0.9501,SEC为0.1803，SECV为0.1722。柠檬酸的最优模型相关系数为0.9211，SEC为0.1043，SECV为0.1761。可以看出新鲜皇冠梨汁中柠檬酸和苹果酸的线性关系均较好,相关系数r均在0.9以上,可以用于实际样品的预测。鲜皇冠梨汁L-苹果酸和柠檬酸的最优模型如表5所示。

表5 柠檬酸和L-苹果酸的最优模型Table 5 The optimal model of citric acid and L-malic acid

2.5 模型验证

为了验证所建近红外定标模型的精确度和准确度,利用所建模型对验证集20个鲜皇冠梨汁样本进行预测,结果如表6所示。由表6可以看出，利用所建模型对鲜皇冠梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的预测效果较好,柠檬酸和L-苹果酸的预测相关系数rp都在0.95以上,其中,L-苹果酸的rp高达0.985,说明化学分析值和近红外分析值之间具有很好的相关性,SEP最低为0.039%,SDR最大为3.46,定标效果良好,所建定量模型有良好的预测性能。

表6 鲜皇冠梨汁中柠檬酸和L-苹果酸含量定标模型的预测结果Table 6 The prediction model results of citric acid and L-malic acid content in Huangguan pear juice

3 结论

利用近红外光谱技术结合统计数学处理方法构建了梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的预测模型。采用SNV、MSC、一阶导数和二阶导数等6种光谱的预处理方法来消除图谱中基线漂移、光散射和噪声等对光谱信息的影响。将不同预处理的方法同PCR法、MPLS和PLS法三种统计数学处理方法相结合分别建立柠檬酸和L-苹果酸的数学模型。通过对比发现,柠檬酸的最适宜模型处理方法为PLS结合MSC,该模型在剔除异常点优化后,其最高相关系数为0.9211;L-苹果酸的最适宜模型处理方法为MPLS结合SNV且去散射,该模型在剔除异常点优化后,其最高相关系数为0.9501。优化后的最佳预测模型预测相关系数最高可达0.985,预测标准差最低为0.039%,相对分析误差最大为3.46。利用此模型可以较为精确地进行梨汁中柠檬酸和L-苹果酸的快速无损检测。本研究为梨汁掺伪快速无损检测提供了参考。