葡萄抗寒相关生理生化指标灰色关联分析1)

李桂荣 程珊珊 张少伟 扈惠灵连艳会周瑞金朱自果

(河南科技学院，河南省·新乡，453003) (河南农业职业学院) (河南科技学院)

The branches of 10 grapes (Manicure Finger, Red Globe, Baixiangjiao, Aromatic of Pecs, Mascat Plevenski, Christmas Rose, Yatomi Rosa, Beta, Vitis amurensis and Beichun) were dealt with different low temperatures (-30 ℃-4 ℃). The relative conductivity, content of malondialdehyde (MDA), soluble sugar content, soluble protein content, free proline content, SOD activity, POD activity and CAT activity were measured. Semi lethal temperature (LT50) was fitted by Logistic equation, the germination rate was determined by recovery growth method, and screening the cold resistance index which was the most associated with the cold resistance by grey correlation analysis. The relative electrical conductivity, MDA, soluble sugar content, soluble protein content and free proline content of all the grape branches were increased. The activity of SOD, POD and CAT increased first and then decreased, and the cold resistance index of these ten grapes with the highest correlation degree was MDA and SOD, the second was POD and soluble sugar. The cold resistance capacity of these ten grapes was sorted in descending order of Vitis amurensis, Beta, Beichun, Red Globe, Baixiangjiao, Manicure Finger, Aromatic of Pecs, Mascat Plevenski, Christmas Rose, and Yatomi Rosa.

葡萄(VitisviniferaL.)为葡萄科葡萄属木质藤本植物，具有营养价值丰富、产量高、经济效益好的特点，深受广大消费者的喜爱[1]。除鲜食外，其他大量用于酿酒、制干、加工等，已经成为我国农业产业化生产的一个重要组成部分[2]。但由于我国北方冬季气候异常寒冷干燥，使得葡萄栽培地区频频发生冻害，导致葡萄产量降低，品质下降，果农经济损失严重，在一定程度上影响和制约了葡萄的种植和发展[3]。因此，抗寒性指标的测定成为葡萄抗寒性研究的热点问题之一[4]。目前对植物抗寒性的研究越来越多，都认为半致死温度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性等可以作为鉴定植物抗寒性强弱的指标[5-7]。本试验选取了10个葡萄品种1年生休眠枝条为材料，进行相对电导率、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数、游离脯氨酸质量分数、SOD活性、POD活性、CAT活性的测定；结合Logistic方程拟合出半致死温度，运用恢复生长法测定萌芽率；通过灰色关联，研究不同抗寒指标和抗寒性关联程度，分析不同葡萄品种的抗寒性。旨在为葡萄抗寒品种资源的合理规划分布、优良品种的抗寒栽培管理及抗寒性强品种的推广提供参考。

1 材料与方法

供试材料采集于中国农业科学院郑州果树研究所葡萄种质资源圃内。以美人指(Manicure Finger)、红地球(Red Globe)、白香蕉(Baixiangjiao)、派克斯(Aromatic of Pecs)、普列文玫瑰(Mascat Plevenski)、圣诞玫瑰(Christmas Rose)、粉红亚都蜜(Yatomi Rosa)、贝达(Beta)、山葡萄(Vitisamurensis)、北醇(Beichun)等10个葡萄品种的1年生休眠枝条为试材。剪取位于中上部、粗0.5～1.0 cm、长度20～50 cm，长势较好的健壮、无病虫害的枝条；标记后，带回进行沙藏。以较耐寒的山葡萄、贝达、北醇作为对照，在河南科技学院园艺植物遗传育种实验室进行试验。

将带回的试验材料，先用流水处理干净，最后用去离子水冲洗3～4次，晾干后再用保鲜膜将枝条按品种分开包好，并做好标记，置于冰箱内进行低温胁迫处理。温度设定梯度依次为4、-5、-10、-15、-20、-25、-30 ℃共7个梯度；4 ℃/h的速率降温，到达处理温度后保持24 h，再以4 ℃/h的速率解冻。取出后置于冰箱中4 ℃保存，用于测定其相关指标，测定时重复3次。

相对电导率用DDSJ-308A型电导仪测定，并用Origin8.0软件进行Logistic方程拟合，根据初电导值和终电导值，求出电解质渗出率，将处理温度和电解质渗出率间的关系用Logistic方程进行拟合，计算半致死温度[8]；丙二醛(MDA)质量摩尔浓度的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，可溶性糖质量分数采用蒽酮法测定，可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝法测定，游离脯氨酸质量分数采用茚三酮比色法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法测定、过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[9]。对葡萄枝条不同抗寒指标和抗寒性关联程度做灰色关联分析，采用DPS9.50软件进行关联系数计算：

式中：minΔi(k)、maxΔi(k)分别为所有比较数列绝对差值的最小值和最大值，本研究中minΔi(k)为0、maxΔi(k)为0.499 5；Δi(k)为第i个比较数列绝对差值；ρ为分辨系数，0<ρ<1，通常取0.5。

试验数据采用Excel 2010、Origin8.0、DPS9.50软件进行方差统计和数据整理分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫时葡萄枝条电导率的测定

电解质渗出率与处理温度的高低、持续时间密切相关[10]。相对电导率变化的幅度与葡萄品种的抗寒性呈反比，变化幅度大，抗寒性差，变化幅度小，抗寒性强[11]。由表1可见：随着温度下降，葡萄枝条相对电导率的总体趋势在增加。在-20～-30 ℃低温胁迫处理后，贝达、山葡萄、北醇的相对电导率显著低于其他品种，贝达相对电导率从(43.59±0.04)%上升至(50.17±0.35)%，山葡萄相对电导率从(37.66±0.02)%上升至(42.23±0.39)%，北醇相对电导率从(45.21±0.06)%上升至(54.70±0.66)%。且贝达、山葡萄、北醇相对电导率的变化幅度远远小于其他品种，故其抗寒性大于其他品种。-30 ℃低温胁迫处理时，各品种达到最高值，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。

表1 不同低温胁迫处理下葡萄枝条相对电导率变化

温度/℃相对电导率/%白香蕉普列文玫瑰派可斯粉红亚都蜜圣诞玫瑰4(41.40±0.56)G(48.28±0.30)F(42.53±0.50)F(51.31±0.42)E(45.37±0.18)E-5(43.58±0.20)F(46.51±0.30)G(43.07±0.19)F(50.98±0.40)F(41.85±0.47)F-10(45.21±0.60)E(55.27±0.45)D(45.46±0.20)E(50.31±0.47)F(36.31±0.36)G-15(48.81±0.25)D(51.47±0.31)E(52.31±0.52)C(59.37±0.21)D(54.18±0.26)D-20(59.36±0.28)C(63.41±0.38)B(50.20±0.34)D(77.66±0.27)B(73.98±0.44)B-25(65.53±0.25)B(57.69±0.56)C(63.57±0.28)B(61.26±0.29)C(72.21±0.31)C-30(75.81±0.39)A(79.04±0.41)A(75.95±0.28)A(80.26±0.36)A(76.73±0.39)A

注：表中数据为“平均值±标准差”；数据后同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.2 Logistic方程拟合葡萄低温半致死温度

10个葡萄品种的半致死温度用Logistic方程拟合结果如表2所示，求得的半致死温度会因材料耐寒性不同而不同。半致死温度作为植物忍受的临界值，如果处理温度低于半致死温度，膜的透性就会增强，电解质渗出率也会随之增大。反之，处理温度高于半致死温度，膜的透性就会降低，电解质渗出率也就会随之降低。根据Logistic方程计算出的半致死温度可知，粉红亚都蜜的半致死温度为-9.85 ℃，抵御外界低温能力最低；山葡萄的半致死温度为-37.83 ℃，抵御外界低温能力最强。10个葡萄品种的抗寒性，从强到弱依次为：山葡萄、贝达、北醇、红地球、白香蕉、美人指、派克斯、普列文玫瑰、圣诞玫瑰、粉红亚都蜜。

表2 低温胁迫时不同葡萄枝条半致死温度

注：pe为电解质渗出率，t为胁迫温度。

2.3 低温胁迫时葡萄枝条生理指标的测定

MDA质量摩尔浓度的增加，是植物受到逆境胁迫后细胞膜透性增加的一个重要标志，其质量摩尔浓度可以反映植物膜系统的受伤程度[12]。由表3可见：不同葡萄品种的MDA质量摩尔浓度，随着温度下降呈现出上升趋势，但上升的幅度因品种的不同而有一定的差异。各品种在-15～-20 ℃剧增之后缓慢增加，温度降到-20 ℃时，粉红亚都蜜和圣诞玫瑰出现了明显的跃升。粉红亚都蜜MDA质量摩尔浓度从4 ℃时的(0.29±0.01)μmol·g-1上升到-20 ℃的(0.66±0.01)μmol·g-1，圣诞玫瑰MDA质量摩尔浓度从4 ℃时的(0.29±0.01)μmol·g-1上升到-20 ℃的(0.64±0.01)μmol·g-1。在-30 ℃时，MDA质量摩尔浓度达到最大值的美人指为(0.67±0.02)μmol·g-1、红地球为(0.55±0.02)μmol·g-1、白香蕉为(0.65±0.03)μmol·g-1、粉红亚都蜜为(0.74±0.01)μmol·g-1、圣诞玫瑰为(0.71±0.01)μmol·g-1。而山葡萄和贝达增加的幅度较小，上升也比较平缓，两者在-30 ℃时达到最大值，山葡萄MDA质量摩尔浓度为(0.38±0.01)μmol·g-1，贝达的MDA质量摩尔浓度为(0.39±0.02)μmol·g-1。在逆境的胁迫时，植物器官常发生膜脂过氧化作用，过氧化作用的产物是MDA，MDA对生物膜的稳定性具有损害作用。MDA质量摩尔浓度高且增加幅度快的，则其抗寒性弱；MDA质量摩尔浓度低且增加幅度小的，则其抗寒性强。

可溶性糖对植物能否安全越冬有着重要作用，在低温胁迫时随着温度的降低，淀粉水解，导致可溶性糖质量分数增加[13]。由表3可见：不同葡萄品种可溶性糖的质量分数，随着温度下降逐渐升高。各品种在-15～-20 ℃，剧增之后缓慢增加，粉红亚都蜜和圣诞玫瑰的可溶性糖质量分数在-20 ℃时急剧上升，分别达到了(2.89±0.08)%、(3.94±0.03)%；而在-20 ℃时，山葡萄和贝达可溶性糖的质量分数分别为(5.43±0.09)%、(4.97±0.17)%，在-30 ℃时达到最大值，分别为(7.32±0.11)%、(6.96±0.14)%，且与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。在-30 ℃时，可溶性糖质量分数达到最高值的美人指为(5.87±0.19)%、红地球为(6.34±0.05)%、白香蕉为(6.13±0.05)%、粉红亚都蜜为(5.14±0.02)%、圣诞玫瑰为(5.23±0.07)%，且与其他温度相比差异显著(P<0.01)。对不同品种之间不同低温胁迫时可溶性糖质量分数进行方差分析表明，抗寒性强的山葡萄和贝达，比抗寒性弱的粉红亚都蜜和圣诞玫瑰的增幅大；山葡萄和贝达可溶性糖质量分数与其他8个葡萄品种差异极显著(P<0.01)。

可溶性蛋白是植物组织的保护物质，能显著增强细胞的保水能力，其质量分数的增加，可以起到降低植物受到伤害的作用[14]。由表3可见：可溶性蛋白质量分数随着温度下降而逐渐升高。山葡萄可溶性蛋白质量分数，从4 ℃的(0.25±0.02)mg·g-1上升到-25 ℃的(0.81±0.02)mg·g-1，达到-30 ℃的(0.84±0.03)mg·g-1时差异极显著(P<0.01)；贝达可溶性蛋白质量分数从4 ℃的(0.23±0.01)mg·g-1上升到-25 ℃的(0.80±0.02)mg·g-1，达到-30 ℃的(0.81±0.02)mg·g-1时差异极显著(P<0.01)；北醇可溶性蛋白的质量分数，从4 ℃的(0.23±0.04)mg·g-1上升到-25 ℃的(0.71±0.01)mg·g-1，达到-30 ℃的(0.72±0.01)mg·g-1时差异极显著(P<0.01)。粉红亚都蜜、圣诞玫瑰、普列文玫瑰、派克斯4种葡萄的可溶性蛋白质量分数在-15～-25 ℃时缓慢上升，在-30 ℃时差异极显著(P<0.01)，粉红亚都蜜的为(0.47±0.01)mg·g-1、圣诞玫瑰的为(0.48±0.01)mg·g-1、普列文玫瑰的为(0.50±0.01)mg·g-1、派克斯的为(0.52±0.01)mg·g-1。白香蕉和美人指可溶性蛋白的质量分数，均在-10 ℃出现最高值，分别为(0.85±0.03)mg·g-1、(0.95±0.01)mg·g-1，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。红地球可溶性蛋白质量分数在-15 ℃时出现最高值(0.85±0.01)mg·g-1，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。可溶性蛋白有较强的亲水性，可以增强植物细胞的持水力，减轻植物体内因原生质结冰所造成的伤害[15]。

由表3可见：游离脯氨酸质量分数，随着温度下降，呈现出上升趋势，但上升的幅度，因品种不同而表现出一定的差异。对于抗寒性较强的山葡萄和贝达，当温度降低到-25 ℃时，游离脯氨酸质量分数达到最大值，分别为(63.28±0.17)μg·g-1、(59.28±0.18)μg·g-1，此时P<0.01。对于抗寒性较弱的粉红亚都蜜和圣诞玫瑰，在温度下降到-5 ℃时，粉红亚都蜜游离脯氨酸质量分数达到最大值，为(33.80±0.15)μg·g-1；在温度下降到-10 ℃时，圣诞玫瑰游离脯氨酸质量分数达到最大值，为(36.05±0.22)μg·g-1。白香蕉和美人指游离脯氨酸质量分数均在-10 ℃时出现最高值，分别为(42.54±0.14)μg·g-1、(40.98±0.07)μg·g-1，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。红地球游离脯氨酸质量分数，在-20 ℃时出现最高值，为(45.93±0.37)μg·g-1。在低温胁迫时，植物体内的游离脯氨酸大量积累，表明葡萄枝条可以通过降低渗透势维持细胞膜结构的完整性。

由此可得出，供试品种的抗寒性由强到弱依次为山葡萄、贝达、北醇、红地球、白香蕉、美人指、派克斯、普列文玫瑰、圣诞玫瑰、粉红亚都蜜。

表3 低温胁迫时葡萄枝条生理指标的测定

续(表3)

注：表中数据为“平均值±标准差”； 同一葡萄品种，数据后同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.4 低温胁迫时葡萄枝条酶活性的测定

由表4可见：随着温度下降，葡萄枝条内SOD活性的变化趋势先上升后下降；各品种均在-25 ℃时SOD活性达到最高值，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)；说明在-25 ℃时，酶抵御低温的能力达到最大，之后酶活性丧失。葡萄枝条内POD活性的变化趋势为先上升后下降；各品种均在-20 ℃时POD活性达到最高值，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。葡萄枝条内CAT活性的变化趋势为先上升后下降，且在-25～-30 ℃各品种又有不同幅度的上升；各品种均在-20 ℃时CAT活性达到最高值，与其他温度相比差异极显著(P<0.01)。其中，贝达、山葡萄、北醇的SOD活性、POD活性、CAT活性显著大于其他品种，且其变化的幅度小于其他品种，说明其抗寒性高于其他品种。

由此可知，不同葡萄品种所测的酶活性总体趋势呈S型曲线上升。SOD在-25 ℃时达到峰值，增加幅度最大，在4～-25 ℃时细胞系统产生了自我保护功能，这种保护能力逐渐上升，超过-25 ℃时，这种保护能力丧失；而POD和CAT在-20 ℃时达到峰值，增加幅度最大，超过-20 ℃时，细胞膜造成了严重伤害，膜系统受到破坏。因此得出，供试品种抗寒性由强到弱依次为山葡萄、贝达、北醇、红地球、白香蕉、美人指、派克斯、普列文玫瑰、圣诞玫瑰、粉红亚都蜜。

表4 低温胁迫时葡萄枝条酶活性的测定

续(表4)

注：表中数据为“平均值±标准差”；同一葡萄品种，数据后同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.5 不同抗寒指标灰色关联分析

为了研究葡萄枝条不同抗寒指标和抗寒性关联程度，做灰色关联分析。依据色系统理论，将不同抗寒指标的平均值和不同处理温度视为一个整体，即灰色系统，进行分析。

对数据进行标准化处理之后，由表5可知：和山葡萄抗寒性关联最大的抗寒指标是MDA(0.73)，其次是POD(0.72)和可溶性糖(0.72)，其他指标均在0.60以上；和粉红亚都蜜抗寒性关联最大的抗寒指标是SOD(0.72)，并且和粉红亚都蜜关联最高的温度是-15 ℃。

综上可知，10个葡萄品种关联度最高的抗寒指标分别是MDA、SOD，其次是POD、可溶性糖。

表5 山葡萄、粉红亚都蜜生理生化指标与抗寒性的灰色关联度

2.6 不同低温胁迫处理时葡萄枝条的萌芽率变化

由表6可见：随着温度下降，葡萄枝条萌芽率的变化趋势为持续上升，4 ℃时各品种的萌芽率均为100%，与其他温度下的萌芽率相比差异极显著(P<0.01)。经-15 ℃处理后，除美人指、粉红亚都蜜、白香蕉外，其他各品种萌芽率均在50%以上，其中贝达、山葡萄、北醇的萌芽率，分别为(79.64±0.19)%、(82.28±0.39)%、(72.59±0.05)%，显著大于其他品种。经-20 ℃处理后，除贝达、山葡萄外，其他各品种的萌芽率均低于50%，其中粉红亚都蜜最小，仅为(6.71±0.05)%。经-25 ℃处理后，仅粉红亚都蜜萌芽率为0，表明粉红亚都蜜的抗寒性不如其他品种，这与酶活性和相对电导率以及生理指标的测定结果一致。

表6 不同低温胁迫处理时葡萄枝条的萌芽率

注：表中数据为“平均值±标准差”；数据后同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

由图1可见：经-25 ℃处理的山葡萄与粉红亚都蜜，通过恢复生长后，山葡萄仍能萌发生叶，且生出较长的须根；而粉红亚都蜜则没有萌发生叶，也没有生根。

3 结论与讨论

通过人工控温，对试材进行低温胁迫处理。半致死温度测定结果表明，随着温度下降，相对电导率呈不断上升趋势。10种葡萄的半致死温度，用Logistic方程拟合结果：美人指为-15.30 ℃、红地球为-20.78 ℃、白香蕉为-18.42 ℃、普列文玫瑰为-12.31 ℃、派克斯为-13.80 ℃、山葡萄为-37.83 ℃、贝达为-36.01 ℃、粉红亚都蜜为-9.85 ℃、圣诞玫瑰为-11.65 ℃、北醇为-31.88 ℃。山葡萄的半致死温度最低，细胞伤害率最小，因此抗寒性最高；而粉红亚都蜜的半致死温度最高，细胞伤害率最大，因此抗寒性最低。综合低温胁迫处理后的SOD活性、CAT活性、POD活性、MDA质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数、游离脯氨酸质量分数及通过恢复生长法测出的萌芽率，对抗寒指标进行灰色关联分析表明，10个葡萄品种关联度最高的抗寒指标分别是MDA、SOD，其次是POD、可溶性糖。综合结果分析表明，10种葡萄抗寒性由强到弱依次为山葡萄、贝达、北醇、红地球、白香蕉、美人指、派克斯、普列文玫瑰、圣诞玫瑰、粉红亚都蜜。

图1 不同低温胁迫处理时恢复生长后山葡萄与粉红亚都蜜的萌发情况

世界上多数植物都会受到低温影响而发生冻害，这种低温伤害也是葡萄育种、生产栽培中经常发生的一种自然灾害。葡萄具有营养价值丰富、产量高、经济效益好的特点，广受人民的喜爱。但受到低温伤害后，品质下降，产量降低，果农经济损失严重。因此，葡萄抗寒性测定评价成为当今热点研究问题之一[16-17]。为了选育出抗寒性高，适宜不同地区生产栽培的耐寒葡萄品种，本试验优选了10个葡萄品种作为研究对象。通过Logistic方程拟合得出不同葡萄品种的半致死温度，结合不同葡萄品种在不同温度处理下的相对电导率和MDA质量摩尔浓度可知，相对电导率和MDA质量摩尔浓度低并随温度的下降升高幅度小，说明半致死温度越低的葡萄品种，抵御外界低温的能力越强，抗寒性越高，这与张鹏翀[18]研究结果一致。不同葡萄品种的MDA质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数、游离脯氨酸质量分数等均随温度下降而逐渐升高，这与文献[19]、[20]研究的结果相一致。低温胁迫时，植物脂质过氧化产物丙二醛大量积累，对细胞膜和细胞造成一定的损伤[21]，其质量摩尔浓度越高植物受到的伤害越大。曲凌慧等[22]通过低温胁迫对各种不同葡萄的酶活性进行测定，研究表明各种酶活性(SOD、POD、CAT)，在一定低温范围内，均表现为酶活性越高，抗寒性越强。超过一定的低温范围，则其酶活性逐渐下降至最终丧失，失去对细胞膜的保护功能。

综上所述，相对电导率、MDA质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数、游离脯氨酸质量分数、SOD活性、POD活性、CAT活性，可作为判定植物抗寒性强弱的生理生化指标。本试验是在人工模拟低温的条件下进行的，与室外自然条件存在着一定的差异和局限性，后续研究中将在室外低温的条件下进行抗寒鉴定，并对各个葡萄品种全面做好后期恢复生长的研究。