重金属铜对动物的急性毒性试验

郑行泉 福建省福州市马尾区畜牧站 福州 350015

铜是动物体内不可缺少的元素，尤其在体内酶促链中作用更为明显，是许多酶类 （如赖氨酰氧化酶、超氧化物歧化酶和细胞色素C氧化酶等）的主要构成成分，在机体造血、新陈代谢、生长繁殖、生产性能和增强机体抵抗力等方面具有不可替代的作用。但过量的铜会在体内富集，对蛋白质和酶会产生毒害作用[1]。铜已逐渐成为环境的主要污染物之一，农业、水产养殖业上铜的大量使用[2]，导致铜离子的污染日趋严重，通过调查得知鱼塘中淤泥所含的重金属含量严重超标[3]，在中国也存在着农药滥用的现象，而农药中也含有重金属铜[4]。

采用实验室含水硫酸铜，按水生动物急性毒性试验的要求分组设计不同浓度组，对斑马鱼进行24 h、48 h急性毒性试验。对所提出的问题加以证明，以了解重金属铜对动物和环境的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 实验室硫酸铜CuSO4·5H2O，分子量为249.68。

1.1.2 试验仪器 1 000 mL大烧杯2个，500 mL中烧杯2个，同型塑料小桶容量为3 500 mL 40个，温度计1根，电子天平1台，注射器3个，大水箱2个。

1.1.3 试验动物 健康试验用斑马鱼，购自福州某花鸟市场。挑选长度一致的斑马鱼，雌雄不限。规格要求为健康，判断标准为体形正常、鳞片完整，各鱼鳍舒展无缺陷，行动活泼，食欲好，大小基本一致。

1.1.4 自来水的去氯处理 先用大水箱装上自来水，然后将其置于通风、透光的地方放置24 h以上，以除去自来水中的余氯，由于斑马鱼对氯十分敏感，因此，试验所用的水应该充分曝气后方可使用。

1.2 试验方法

1.2.1 试验液的配制 利用电子天平称量所需硫酸铜的重量，将其溶于一定体积的曝氯水体中，配得一定高浓度母液。以母液为基础进行适当稀释，以得到不同浓度梯度的试验液。

1.2.2 试验鱼的饲养 从花鸟市场将试验鱼充满氧气运至实验室，饲养总数为140尾左右，饲养所用的水必须是充分曝气后的水，饲养期间每天投少量的饵料，饲养1 d后用于试验。死亡率在10%以下时，才可开始试验。

1.2.3 先进行预试验 查找参考文献，掌握所做试验水生生物的24 h和48 h全数致死浓度及全数不死浓度。设计7个质量浓度梯度以测定所查数据的准确性。每个试验塑料桶中加入1 L曝氯水，然后分别加入所需的硫酸铜溶液，每个试验容器投放斑马鱼10尾，水体温度保持在22～25℃。之后进行24 h急性毒性试验，分别记录各组的死亡数，用同样方法进行48 h急性毒性试验。从而得出所做试验水生生物的全数致死浓度和全数不死浓度。

1.2.4 试验设计 根据预试验结果，在所查文献数据基础上，设置7个质量浓度梯度，每组分别放入10尾斑马鱼。用预试验的相同方法养殖，记录24 h的斑马鱼死亡率。试验鱼的中毒死亡过程表现为：呼吸频率无规则，鱼头上浮，腹部侧斜并朝向水面，经短暂挣扎后，沉入水底静卧于试验容器底部直至完全死亡。按照同样试验方法记录48 h的斑马鱼死亡率。

1.2.5 LD50测定 试验完毕，清点各组死亡鱼数，计算出死亡率（P）。按改进寇氏法公式计算：LD50（mg/L）=lg-1[xm-i（∑P-0.5）]。

式中xm：最大剂量组剂量的对数值；i：相邻两组剂量（d）对数值之差，即 i=lgd3-lgd2=lgd2-lgd1，或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；P：各组鱼的死亡率，用小数表示（如死亡率为100%应写成1.0）；∑P：为各组鱼死亡率的总和。

lg LD50的标准误 （Sx50）计算公式如下：Sx50=i*[（∑P- ∑P2）/（n-1）]1/2。 式中 n： 每组的鱼数；Sx50：lgLD50的标准误，x50=lg LD50。

LD50的 95%可信限=lg-1（x50±1.96 Sx50）；LD50的平均可信限=LD50±（LD50高限-LD50低限）/2。

2 结 果

2.1重金属铜对斑马鱼的24 h急性毒性影响 斑马鱼在不同浓度硫酸铜溶液的环境下试验24 h的死亡率，见表1。经计算可得：LD50=0.2 536 mg/L，Sx50=0.06 081；LD50的 95%可信限=0.1 927～0.3 336 mg/L；LD50的平均可信限=0.2 536±0.07 045 mg/L。由于通过事先查阅浓度资料和预试验，得到了较为准确的分组结果，试验结果较为清楚，梯度明显。

表1 重金属铜对斑马鱼的24 h急性毒性

2.2 重金属铜对斑马鱼的48 h急性毒性影响 斑马鱼在不同浓度硫酸铜溶液的环境下试验48 h的死亡率，见表2。经计算可得：LD50=0.1 035 mg/L，Sx50=0.03 532；LD50的 95%可信限=0.08 824～0.1 214 mg/L；LD50的平均可信限=0.1 035±0.01 658 mg/L。最后一组试验数据不理想，还有1尾斑马鱼未死亡，可能造成最终结果有误差。

3 分析与讨论

1）本试验24 h和48 h的LD50结果比所查资料的数据略高，分析可能有以下几种原因：（1）福州天气早晚温差大，斑马鱼可能有部分是因不适应气候而死亡的。（2）实验室所取的水后来经检测呈酸性，试验时的水可能未充分曝气，而斑马鱼对氯十分敏感，可能有部分斑马鱼由于受氯刺激而死亡。

表2 重金属铜对斑马鱼的48 h急性毒性

2）近年来，斑马鱼的胚胎毒性试验逐步成为生态毒理学研究的一种重要方法，也是各国标准组织认可的测定单一化学品毒性的标准方法之一。优势主要表现为：其基因与人类基因的相似度很高，这意味着在其身上做药物试验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此，受到广泛重视。其次，斑马鱼的胚胎透明，这使得研究者很容易观察到药物对其体内器官的影响，比如原肠期的细胞运动、脑区形成、心跳及血液循环等胚胎发育事件。此外，斑马鱼具有常年产卵、胎体透明、易于观察、成本较低、可重复性好和灵敏度高等优点[5]。

3）重金属离子急性中毒对大脑的影响主要在于对神经元的损伤，引起神经细胞皱缩，可能是重金属离子与质膜某些阴离子结合，使质膜溃散、原生质外溢；也可能是重金属离子进入原生质，与蛋白质的-SH基结合引起变性凝集，从而导致神经元变瘪[6]。同时重金属铜对鱼体内的胃蛋白酶和淀粉酶也有影响，王维娜等[7]报道，低浓度铜离子对日本沼虾体内碱性磷酸酶、胃蛋白酶和类胰蛋白酶起诱导激活作用，而高浓度铜离子（8 g/L）则具有抑制作用，且随着铜离子浓度升高，其抑制作用更加明显，这可能是外界环境中重金属离子浓度过高破坏了动物自身的生理调节过程。

4）由此可见，重金属铜对于斑马鱼的毒性是很强的，同时重金属在鱼体内会慢慢沉积[8]，最后进入食物链，影响人类的健康。泥鳅是一种对水环境耐受能力较强的生物，但即使是泥鳅在几种重金属环境中也无法生存，可见重金属污染的危害[9]。当前，不仅仅在水产养殖上有使用含铜消毒剂，而且在饲料、兽药中也广泛使用，使重金属铜的污染更加严重[10]。

4 结 论

重金属铜对斑马鱼有很强的毒性，斑马鱼在0.91 mg/L浓度的水中24 h内的死亡率达到100%，24 h半数致死浓度为0.2 536 mg/L，48 h的半数致死浓度为0.1 035 mg/L。通过试验，可以充分认识到重金属铜对动物的毒性，应该谨慎使用含铜药物或饲料。