正交试验确定扇贝蛋白质沉淀的最佳条件

王娜 张国庚

(河北农业大学渤海校区，河北沧州 061100)

1 材料与方法

1.1 实验原理

水产品中的蛋白质提取可以利用氯化钠在恒温水浴锅不同时间和温度实现，用考马斯亮蓝G-250作为染料，与蛋白质结合后呈蓝色，波长595nm处测定光吸收值，光吸收值与蛋白质含量成正比。

1.2 实验材料和试剂

(1)扇贝(河北沧州黄骅市海鲜市场)；

(2)蛋白质标准溶液的配制[1]；

(3)考马斯亮蓝G-250试剂的配制[2]。

1.3 实验仪器

721型可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；漏斗；滤纸；烧杯；玻璃棒；量筒；手动匀浆器，容量瓶。

1.4 实验方法

a. 取三只小烧杯，各放入2g扇贝肉，调节恒温水浴锅温度85℃、90℃、95℃，用手动匀浆器搅碎贝肉，配制浓度分别为1%、5%、10%的氯化钠溶液100mL于3个锥形瓶中，恒温水浴锅里分别煮30min、45min、60min，过滤后提取液定容到100mL。

以此类推，做L9正交试验。

b. 蛋白质含量的测定

c. 标准曲线的制作

取6支试管并编号，按下表1加入试剂，摇匀后静置2min，595nm波长下比色测定。

表1 制作标准曲线所加试剂

d. 蛋白质含量测定

加入样品提取液0.1mL，考马斯亮蓝G-250试剂5mL，静置2min，曲线1号试管作参比，595nm波长下比色，记录光吸收值，比较样品蛋白质的含量[3]。

1.5 数据处理

a. 蛋白质标准曲线

以牛血清蛋白含量(μg)作为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制尺度曲线[4]。

图1 蛋白质的标准曲线

由图1可得蛋白质含量的曲线是y=0.0065x-0.0013，根据此方程便可得到正交试验9个样品蛋白质的含量。

b. 确定正交试验分析最佳条件

影响蛋白质沉淀的因素很多，如温度、溶剂浓度、温度，进行了正交实验。正交身分程度见表2，正交试验成果见表3和表4。

正交的统计分析分为直观和方差分析法两种[5]，直观分析法计较简略、快速，可是会有偏差。方差分析法较精确，但计算步骤烦琐，结果出来较慢，二者各有利弊，本文采用两种方法进行比较分析。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验结果及极差分析表

表3是直观分析法的统计分析。直观分析按下列步骤进行：

①计算各因素同一水平的指标总和T1、T2、T3，

如A因素温度的1水平T1=45.7

2水平T2=40.9

3水平T3=78.6

同理可得B因素离心时间、C因素离心转速的各水平指标总和。

②计算各因素同一水平的指标平均数t1、t2、t3，

如A因素的1水平t1=45.7/3=15.23

t2=40.9/3=13.63

t3=78.6/3=26.2

同理可得B因素离心时间、C因素离心转速的各水平指标平均数。

③计算各列极差R，

A列R=12.55

B列R=6.97

C列R=8.37

按照极差R的大小即可得到各身分对尝试指标的影响巨细，判定出主次干系。极差越大，该对尝试指标的影响越大，也便是主要身分，反之便是次要身分[6]。

由上述③的结果可得A身分为主要身分，B身分次之，C身分最小，它们的主次干系是：A>C>B。

④选出最佳处理组合。

由于本实验是要找到蛋白质的最佳沉淀条件，也就是说提取液中蛋白质含量越少条件越优，所以A因素应该以1水平为最好，所以B因素和C因素也应该以1水平最好。因此最佳处理组合为扇贝蛋白质在温度为85℃，时间为45min，氯化钠浓度为10%时效果最好。

表4 正交试验结果及方差分析表

表4是方差分析法的统计分析。分差分析按下列步骤进行：

①计算

②总平方和

SST=∑X2-T2/n=6.42+62+14.52+13.32+13.42+14.22+20.22+22.22+29.32-139.52/9=2603.7-2162 =441.7

总自由度dfT=9-1=8，

A因素平方和SSA=(26.92+40.92+71.72)/3-2162.0=350.4，A因素自由度dfA=3-1=2；

B因素平方和SSB=66.9，B因素自由度dfB=3-1=2；

C因素平方和SSC=24.1，C因素自由度dfC=3-1=2。

误差平均和SSe=SST-SSA-SSB-SSC=0.3

③列方差分析表，作F检验。

表5 方差分析表

注：*表示显著，**表示极显著

由上表的F与Fa结果比较可得：

FA、FB>F0.01(2，2)，表明A因素的不同水平对于蛋白质的沉淀效果有极显著差异，温度和时间是影响扇贝样液中蛋白质含量的主要因素；

F0.05(2，2)FC则又说明B因素比C因素的影响效果更加明显，但是二者均不如温度对扇贝蛋白质沉淀的影响程度大。

2 结果

本实验通过研究贝肉蛋白质的提取的最佳条件，最终确定扇贝蛋白质在温度为85℃，时间为45min，氯化钠浓度为10%时为最佳沉淀条件，但可能出现操作失误，没有进行重复实验，可能会造成结果不够准确。

3 讨论

实验中还是存在一些不足和漏洞，比如本实验没有进行蛋白质沉淀条件的单因素多水平的实验操作，没有确定温度、恒温水浴时间和氯化钠浓度的单个因素的最佳条件的范围趋势，这样就缺乏了对蛋白质沉淀条件的优化。因而直接进行正交试验缺少了一定的说服力，严格意义上不能称为是蛋白质最佳的沉淀条件，因为三个因素分别只设计了三个水平，范围较模糊粗糙，说服力较低。这是实验自身存在的问题，实验过程中还没有达到让蛋白质完全沉淀的效果，以上结果中可以看出蛋白质在最佳条件时还能被检验出来，本实验还需要进行改善。