强直性脊柱炎患者外周血miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表达分析

姜芳，许敏，郑锡铭

(驻马店市中心医院检验科，驻马店 463000)

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性进行性、炎症性自身免疫疾病，发病多有家族聚集性，炎症多影响全身外周大关节，可累积滑膜关节、软骨关节、肌腱以及韧带附着于骨的部位，使关节融合，导致不可逆性的僵直，具有较高的致畸性和致残性[1，2]。目前，其诊断主要依赖于临床症状及影像学资料；而一些病程短、病情较轻的患者由于缺乏特异性的指标而不能及时地早期诊断[2]。文献报道，基质金属蛋白酶家族(MMP-1、2、3、9)，TNF-α、白细胞介素因子（IL-1、IL-6、IL-15、IL-17）、可溶性血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、高迁移率族蛋白1(HMGB-1)、骨桥蛋白(OPN)、HLA-B27 在 AS 的发病机制中起重要作用[3-8]。我们通过生物信息学分析 发 现 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223可靶向调控 MMPs、TNF-α、IL、VCAM-1、HMGB-1、OPN、HLA-B27 等蛋白的合成（图 1），已有相关研究认为AS患者外周血中miRNA存在差异表达[9-11]，因此有人提出miRNA也可作为AS的一种新型的特异性分子诊断标志物[14]。本研究旨在通过检测AS患者外周血血浆和PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 表达是否有差异性，为AS发病机制的研究和临床诊断提供新思维。

1 材料及方法

图1 各指标诊断丙型肝炎肝硬化的ROC曲线对比图1 利用生物信息学软件预测与AS相关的miRNAs

1.1 研究对象 AS患者为我院2015年1月至2016年1月住院病人60例，临床诊断均符合美国风湿病学会1987年修改的AS纽约标准，其中男性33例，女性27例。年龄14～62岁，平均（28.6±9.4）岁。同时，随机选取30例同时期本院健康体检者作为对照组，男女各15例，年龄为18岁～65岁，平均（32.1±10.1）岁；另外选取类风湿关节炎、骨关节炎及反应性关节炎患者30例作为疾病对照组，其中男性18例，女性12例，年龄为17岁～60岁，平均（30.6±11.3）岁。选取的研究对象均排除其它自身免疫性疾病和重要器官系统疾病。以上样本的收集均获得患者同意及医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血浆、PBMC分离和small RNA提取 取EDTA抗凝血5ml，3000r/min离心5min分离血浆。采用Ficoll分离液分离PBMC。按试剂盒操作说明书提取血浆及PBMC中Small RNA，置无RNA酶水中保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成 设计茎环引物、Realtime PCR上游引物；根据miRBase数据库miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 成熟序列并参考文献设计其茎环引物、特异检引物；通用下游引物：5’-3’：CTCAACTGGTGTCGTGGA。 引物合成及测序由上海生工公司完成。

1.2.3 cDNA合成及RT-PCR检测 使用茎环特异性引物，以 small RNA 为模板，按 42℃，60min，70℃5min条件反转录合成cDNA，4℃保存。采用Top Green qPCR SuperMix反应体系：Top Green qPCR SuperMix 10μl，上、下游引物各 1.0μl，模板 2.0μl，加水至 20.0μl。 反应条件为：95℃ 30s 1cycle；95℃5s，62℃ 30s，72℃ 30s 40 cycles；设置平行复孔，检测结果取平均值，以双标准曲线法进行qPCR定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据采用（±s）表示，所有数据采用单因素方差分析；Pearson相关系数分析miRNA表达量与临床参数之间的相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS 患者血 浆中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223表达 AS患者血浆中 miR-146a、miR-155、miR-181a和miR-223表达水平上调，显著高于其在对照组中的表达（P＜0.05），详见表1。

表 1 血浆 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 表达

2.2 AS 患者 PBMC 中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223表达 AS患者PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a和miR-223表达水平上调，显著高于其在对照组中的表达；同时，除miR-223外，miR-146a、miR-155和 miR-181a在 PBMC 中表达水平也高于其在血浆中的表达（P＜0.05），详见表2。

表 2 PBMC miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 表达

2.3 AS患者血浆及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的相关性分析 Pearsion相关分析显示，AS组血浆与PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 存在显著正相关（r依次为0.845、0.781、0.899、0.807，P＜0.05）；详见表 3。

表3 血浆PBMC中miRNA相关性分析

2.4 AS患者血浆、PBMC中miRNA与HLA-B27、CRP、ESR的相关性分析 Pearsion相关分析显示，血浆与 PBMC中 miRNA 与 HLA-B27、CRP、ESR存在一定的相关性；血浆中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 与HLA-B27、ESR、CRP 正相关 （r 依 次 为 0.372*、0.462、0.576、0.373*、0.516、0.603、0.483、0.560、0.635、0.478、0.544、0.324）。PBMC 中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223与 HLA-B27、ESR、CRP 正相关 （r依次为 0.482、0.622、0.535、0.431、0.636、0.565、0.493、0.578、0.555、0.439、0.504、0.412）；详见表 4。

2.5 AS患者血浆及 PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 ROC曲线分析 为评估血浆及PBMC中miRNA对AS的诊断价值，对AS患者血浆和 PBMC 中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表达量进行ROC分析，结果见表5。对miR-146a来说，其血浆诊断临界值为8.18×109(copies/μl)时，敏感度为85.00%，特异度为93.33%；其血 PBMC诊断临界值为 5.15×1011(copies/μl)时，敏感度为 73.33%，特异度为76.67%。。对miR-155来说，其血浆诊断临界值为3.95×103(copies/μl)时，敏感度为 80.00%，特异度为83.33%；其血 PBMC诊断临界值为 6.05×103(copies/μl)时，敏感度为75.00%，特异度为80.00%。对miR-181a来说，其血浆诊断临界值为4.86×102(copies/μl)时，敏感度为85.00%，特异度为86.67%；其血 PBMC诊断临界值为 5.90×103(copies/μl)时，敏感度为75.00%，特异度为80.00%。对miR-223来说，其血浆诊断临界值为 6.25×109(copies/μl)时，敏感度为61.67%，特异度为56.67%；其血PBMC诊断临界值为1.51×108(copies/μl)时，敏感度为75.00%，特异度为80.00%。详见图2。

表4 血浆、PBMC中miRNA与HLA-B27、CRP、ESR的相关性分析

图2 血浆及PBMC 中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 ROC曲线

2.6 AS患者血浆及 PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的 Logistic回归分析 为探究 AS患者血浆和 PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223在AS发病过程中发挥的作用，对其在患者中表达量的进行多因素Logistic回归分析，结果见表6。

表5 AS患者血浆及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的ROC曲线分析

表6 患者血浆及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的Logistic回归分析

3 讨论

强直性脊柱炎（AS）作为一种原因复杂的炎性自身免疫性疾病，引起骶髂关节及脊柱附着点炎症，累及腰椎、胸椎等关节，进而导致骨性强直。目前研究认为该病与机体免疫功能异常密切相关。miRNA作为一类小片段内源性非编码RNA，在多种炎性和自身免疫功能调节过程中发挥着重要作用。。miR-146a在类风湿关节炎患者表达明显增加[12]，而在系统性红斑狠疮患者体内的表达明显减少[13]，有研究报道，在AS患者过表达的miR-146a能有效抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）和白细胞介素一1受体相关激酶1（IRAK1）的表达，促进破骨细胞的产生过多，进而导致骨破坏[14]。miR-155能够通过激活核因子κB(NF-κB)信号通路，介导炎症因子的合成，促进炎性因子的表达，同时刺激抗原特异性辅助性T细胞17(Thl7)及自身抗体的生成，加剧机体炎症损伤；另外，miR-155可通过下调其靶标IKBKE的表达来抑制MMP-3的分泌，在AS患者骨质破坏过程中发挥一定的保护作用[11，15]。miR-181在T细胞免疫发挥作用过程中起到重要作用，miR-181表达水平的改变可能引起自身免疫性疾病的发生[16]。在系统性红斑狼疮患者外周血PBMC中miR-181的表达水平较对照组表达下调，引起其靶基因PCAF(P300PCBP associated factor)的表达量增高，介导基质金属蛋白酶的活性[17]。过量破骨活动导致一系列的骨代谢紊乱miRNAs是破骨细胞分化的一个关键因素，miR-223对破骨细胞分化起着关键作用。Sugatani T的研究发现，miR-223高表达能抑制破骨细胞分化，因此miR-223可能作为AS一个治疗的靶点[18]。早期的研究表明，血清miR-223在AS患者呈高表达，并且在疾病活动期表达更高，表明其表达水平不仅可以体现疾病的存在，且可以反应疾病严重程度。本组研究结果表明，AS患者血浆及PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a 和 miR-223 表达水平上调，显著高于其在对照组中的表达，并且具有显著的相关性。

HLA-B27、ESR、CRP作为临床常用的 AS诊断及疾病活动监测指标，Pearsion相关分析显示，血浆及 PBMC中 miRNA 与 HLA-B27、CRP、ESR存在一定的正相关性。这提示miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表达上调与AS的病情活动性相关。对血浆及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表达量进行 ROC分析发现，其对AS具有很强的临床诊断能力。多因素Logistic 回归分析发现，miR-146a、miR-155、miR-181a及miR-223对AS均具有一定的致病作用，其中miR-146a的作用尤为显著。

综上所述，本研究发现miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223在 AS患者血浆、PBMC中表达上调，其表达水平可作为AS潜在的诊断指标。miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 可通过靶向相关的致病基因在AS的发病过程中发挥重要作用，但其在AS发病机制中可能发挥的具体作用目前尚不清楚，有待进一步研究，以便为AS的治疗提供新的方向。