超滤法测定盐酸麻黄碱的血浆蛋白结合率

鲍慧玮，徐 阳，刘芳馨

(1.长春中医药大学，吉林长春 130117；2.长春医学高等专科学校，吉林长春 130000)

盐酸麻黄碱[(1R，2S)-(-)-ephedrine hydrochloride](图1)为麻黄科植物草麻黄(EphedrasinicaStapf)、中麻黄(EphedraintermediaSchrenk et C. A. Mey.)或木贼麻黄(EphedraequisetinaBge.)的活性物质，也是《中国药典》(2015年版)中麻黄的质控指标之一[1]。由于化学结构与肾上腺素相似，麻黄碱具有拟肾上腺素样作用，可用于支气管哮喘、百日咳、枯草热及其他过敏性疾病，能对抗脊椎麻醉引起的血压降低、扩大瞳孔，也用于重症肌无力、痛经等疾患，还可作中枢神经系统兴奋剂[2-4]。

药物的血浆蛋白结合率是影响药物发挥药效的重要因素，是研究药物代谢动力学、药物作用机制等方面的参数依据[5-6]。盐酸麻黄碱的药理作用广泛，而文献中未曾报导过对盐酸麻黄碱血浆蛋白结合率测定的研究，故本实验采用超滤法结合HPLC法[7-8]对盐酸麻黄碱与小鼠、大鼠、家兔血浆蛋白结合率的测定进行研究，以期为其更准确的临床应用提供依据。

图1 盐酸麻黄碱的化学结构式

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-2030型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；TGL-16B台式高速离心机(湖南星科科学仪器有限公司)；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；SK-1快速混匀器(江苏金坛市江南仪器制造厂)；DT5001型电子称(常熟市意欧仪器仪表有限公司)；AB135-S型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；Millipore 10K型超滤管(美国Millipore公司)。

盐酸麻黄碱(批号：171237-200807，中国食品药品检定研究院)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(分析纯，北京化工厂)。

1.2 实验动物

Wistar大鼠，体重200±20 g；昆明种小鼠，体重20±2 g；家兔，体重2.0±0.5 kg(合格证号：SCXK(吉)-2016-0003、SCXK(吉)-2016-0004，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司)。

小鼠、大鼠、家兔分别采用摘眼球、眼眶、耳缘静脉方式取血，置肝素润洗的离心管中，4000 r·min-1离心10 min，分离血浆，置4℃冰箱中备用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制

取磷酸二氢钾1.36 g，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL，即得pH为7.4的PBS溶液。

1.3.2 对照品溶液的配制

称取盐酸麻黄碱约25 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇超声溶解，并定容至刻度，摇匀，制得质量浓度为5.036 mg·mL-1的盐酸麻黄碱对照品储备液；再精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，PBS溶液稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得质量浓度为0.5036 mg·mL-1的盐酸麻黄碱对照品溶液。

1.3.3 血浆样品溶液的处理

取已配制好的对照品溶液，分别精密移取10 μL、40 μL、100 μL于EP管中，再取新鲜血浆900 μL加入上述溶液中(PBS溶液补足体积至1000 μL)，涡旋震荡，制得低、中、高3种浓度的盐酸麻黄碱血浆样品溶液，置37℃水浴2 h。分别吸取盐酸麻黄碱血浆样品溶液500 μL至超滤管中，6000 r·min-1离心20 min，即得不同浓度的血浆样品超滤液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件与专属性考察

Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇∶0.1%磷酸溶液(15∶85，v/v)，体积流量为1.0 mL·min-1，柱温为25℃，检测波长为210 nm，进样量为20 μL。

吸取PBS溶液100 μL置EP管中，再加入新鲜血浆900 μL置37℃水浴2 h，按照1.3.3制得空白血浆超滤液。在上述色谱条件下进行测定，待测色谱峰峰形良好，与其它色谱峰分离度大于5.0，且无干扰，表明该方法专属性良好。结果见图2(以大鼠血浆为例)。

A.盐酸麻黄碱对照品；B.大鼠血浆样品超滤液；C.空白血浆超滤液图2 盐酸麻黄碱HPLC色谱图

2.2 线性关系考察

精密吸取1.3.2对照品储备溶液20 μL，至2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得浓度为50.36 μg·mL-1的对照品母液。分别移取对照品母液0.15、0.2、0.5、1、2、5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得一系列不同浓度的盐酸麻黄碱对照品溶液。按照上述色谱条件进入检测，记录峰面积。以盐酸麻黄碱质量浓度(c，μg·mL-1)为横坐标，色谱峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，求得盐酸麻黄碱的线性回归方程为y=47920x-21732(r=0.9997)。结果表明，盐酸麻黄碱质量浓度在1.511～50.36 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.3 精密度考察

取1.3.3中浓度大鼠血浆样品超滤液，分别在不同日期、不同人员、不同仪器下进行测定，记录色谱峰面积，计算盐酸麻黄碱质量浓度。结果，大鼠血浆样品超滤液中盐酸麻黄碱质量浓度的RSD值为1.77%，表明该方法精密度良好。

2.4 稳定性考察

取1.3.3中浓度大鼠血浆样品超滤液，分别在0、2、4、6、8、12 h时于上述色谱条件下进行测定，记录色谱峰面积。结果，大鼠血浆样品超滤液中盐酸麻黄碱峰面积的RSD值为1.84%，表明该方法在12 h内稳定性良好。

2.5 重复性考察

分别取新鲜血浆6份，按照1.3.3制备中浓度大鼠血浆样品超滤液，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱峰面积，计算盐酸麻黄碱质量浓度。结果，大鼠血浆样品超滤液中盐酸麻黄碱质量浓度的RSD值为1.13%，表明该方法重复性良好。

2.6 超滤膜回收率试验

取1.3.2中对照品溶液，分别精密移取10 μL、40 μL、100 μL于EP管中，加入PBS溶液至体积1000 μL，涡旋震荡，可得浓度约为5 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1的盐酸麻黄碱-PBS溶液，置于37℃水浴温育2 h。分别精密移取500 μL至超滤管中，6000 r·min-1离心20 min，即得不同浓度的超滤液。对不同浓度的盐酸麻黄碱-PBS溶液和超滤液分别进行测定，计算超滤膜回收率。结果，低、中、高浓度的膜回收率分别为(99.47±1.22)%、(96.44±0.83)%、(95.11±0.79)%，RSD值分别为1.23%、0.86%、0.83%，表明该方法准确度良好。

2.7 血浆蛋白结合率的测定

取1.3.3中不同浓度的血浆样品超滤液，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱峰面积，并计算其血浆蛋白结合率。结果见表1。

其中，C超滤前为超滤前含药物的PBS溶液的浓度；C超滤后为相应血浆样品超滤液的浓度。

由表1结果可知，盐酸麻黄碱与不同属血浆的蛋白均属于较弱结合。通过SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析，盐酸麻黄碱与不同属血浆的蛋白结合率均无浓度依赖性，但不同属血浆与盐酸麻黄碱的蛋白结合率有显著性差异(p<0.05)。

表1 不同属血浆的蛋白结合率

3 讨论

药物经吸收进入血液后，一部分与血浆蛋白结合为结合型药物，只有另一部分游离型的药物才能发挥药效。本文通过测定血浆中游离盐酸麻黄碱的含量，来计算药物与血浆的蛋白结合率。经分析，盐酸麻黄碱与小鼠、大鼠、家兔血浆蛋白均具有较弱的结合，且与浓度不成比，在临床应用中，需避免因竞争结合而引起的游离盐酸麻黄碱浓度升高，为更合理用药提供依据。

根据查阅的文献，血浆蛋白结合率测定方法有平衡透析法、微透析法、超滤法、超速离心法、以光谱学为基础的方法、高效亲和色谱法、微量热法等[9-11]。本文采用超滤法与HPLC法结合的方法，利用半透膜原理，设备简单、操作方便、不受体积迁移和稀释效应的影响，建立一种准确、速率高、成本低的方法实现血浆中游离药物的快速分离。

超滤膜的吸附作用会影响血浆蛋白结合率的测定结果[12]。根据超滤膜吸附率的测定结果分析，浓度越高，吸附率也越大。为了排除吸附率的干扰，计算血浆蛋白结合率时，应用采用超滤膜吸附之后的实际浓度进行计算，结果更加准确。