超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶条件 确定及其对凝胶载体结构的影响

郑德娟,解久莹,丁 琳,程 磊,曹雁平,,*

(1.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心,北京 100048; 2.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048; 3.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048)

近年来,固定化酶技术应用广泛,固定化酶在药物代谢、抗生素生产、食品工业等领域广泛应用,具有制备简单、酶活性高、易于与底物分离、应用广泛等优点[1]。海藻酸钠是一种由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古罗糖醛酸组成的线性聚合物,具有良好的生物相容性和降解性,可在温和条件下实现对蛋白质等生物大分子的包埋[2]。超声是一种物理能量机械波,其在与介质作用时,产生一系列包括空化效应、机械效应和热效应在内的超声效应,并使介质发生物理、化学变化[3]。国内外研究者针对超声对固定化酶酶活性的影响做了大量研究,发现超声能够强化固定化酶的酶活性。吴葛洋等[4]研究发现超声处理后的壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活力提高,但对其最适温度与最适pH没有影响,最大反应速率Vmax提高,Km值下降,超声场使酶与底物的亲和力增加。Stephen等[5]研究发现高强度超声处理可以使α-淀粉酶和糖化酶催化反应速率明显升高,并且减少分子内部和分子间的抑制和破坏,能促进底物分子之间的相互作用,强化反应物进入及生成物离开酶活性中心的传质过程,提高酶活性。黄正华等[6]研究发现超声能够影响海藻酸钠凝胶中酪蛋白的扩散性质及凝胶结构,且扩散与凝胶结构之间存在密切关系。有关超声强化固定化酶酶活性的机制仅涉及超声对其动力学、扩散的研究,固定化酶酶活性与凝胶结构之间关系的研究未见报道。

本文在单因素实验基础上,利用设计均匀试验获得超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活性的最佳超声条件。进一步研究不同超声频率、功率对海藻酸钠凝胶结构的影响,并利用电子显微镜与图像数字化处理技术定量评价凝胶结构变化程度,考察超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性最优条件与凝胶结构变化的一致性。本研究成果将为进一步研究超声对固定化酶的影响机理提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三羟甲基氨基甲烷(Tris) 美国Sigma公司,生化试剂;盐酸、海藻酸钠、无水氯化钙、无水碳酸钠、三氯乙酸、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠 国药集团化学试剂有限公司,化学纯;干酪素 北京奥博星生物技术有限责任公司,生化试剂BR;L-谷胱甘肽 北京拜尔迪生物技术有限公司,生化试剂;福林酚试剂 美国Sigma公司,分析纯;木瓜蛋白酶(测定活力 4.96×105U/g) 美国Sigma公司,生化试剂。

电子天平、分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;pH计 上海三信仪表厂;智能集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司;JXD-02型多频槽式处理系统 北京金星超声波技术设备有限公司;DC-2006型低温恒温水浴锅 浙江宁波新芝生物科技股份有限公司;CR22G离心机 HITACHI公司;UVmini-1240型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;Beta 1-8 LDplus真空冷冻干燥机 德国Christ公司;FEI QUANTA250型扫描电镜 QUANTA250 FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的制备 称取4 g海藻酸钠溶于100 mL Tris-盐酸缓冲液(0.1 mol/L、pH5.87)中,在60 ℃水浴条件下磁力搅拌至溶解均匀,冷却至55 ℃左右,加入0.05 g木瓜蛋白酶,搅拌均匀,用一次性滴管滴入0.8 mol/L CaCl2溶液中,置于4 ℃冰箱冷藏0.5 h。取出后用去离子水洗去凝胶表面多余CaCl2,晾干表面水分。

1.2.2 超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶条件的确定 为考察超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性条件与凝胶结构变化的一致性,以相对酶活力为指标,研究单因素条件下超声对海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶相对酶活力的影响特点,在此基础上采用均匀设计试验法获得超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的最佳条件。

1.2.2.1 超声处理海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶 取1 g固定化木瓜蛋白酶,3 mL谷胱甘肽,10 mL酪蛋白溶液(10 g/L),在40 kHz,40 ℃、0.15 W/cm2条件下处理40 min,测定并计算相对酶活力。

1.2.2.2 单因素实验设计 取1 g固定化木瓜蛋白酶,3 mL谷胱甘肽,10 mL酪蛋白溶液(10 g/L),在不同超声频率(由于仪器限制,选取28、40、50、135 kHz),40 ℃、0.15 W/cm2条件下处理40 min;不同超声功率(0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2),40 ℃、40 kHz条件下处理40 min;不同超声温度(30、40、50、60、70 ℃),0.15 W/cm2、40 kHz条件下处理40 min;在0.15 W/cm2、40 kHz、40 ℃超声条件下处理不同时间(20、30、40、50、60 min),测定并计算相对酶活力。

1.2.2.3 超声处理海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶条件的优化 选取超声频率、功率、温度、时间四个因素,利用DPS软件设计混合水平均匀试验优化超声条件,实验设计见表1。

表1 超声条件的优化选择Table 1 Optimization of ultrasonic conditions

1.2.3 海藻酸钠凝胶膜的制备 为能够考察超声处理对凝胶结构的影响,需要观察凝胶断面的结构变化。为此,需要制成海藻酸钠凝胶膜,以便于在冻干后脆断。

称取4 g海藻酸钠溶于100 mL Tris-盐酸缓冲液(0.1 mol/L、pH5.87)中,60 ℃水浴条件下磁力搅拌至溶解并搅拌均匀,冷却至55 ℃左右,倒入装有0.8 mol/L CaCl2溶液的容器中,置于4 ℃冰箱中冷藏12 h。取出后用去离子水洗去凝胶表面多余CaCl2,晾干表面水分。

1.2.4 超声处理海藻酸钠凝胶膜 将凝胶膜放在盛有300 mL PBS溶液(pH7)1000 mL烧杯中,在不同超声功率(0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2),40 kHz;不同超声频率(28、40、50、135 kHz),0.45 W/cm2;70 ℃条件下处理20 min,晾干表面水分后冷冻干燥处理。

非超声处理的对照组将海藻酸钠凝胶膜放在盛有300 mL PBS溶液(pH7)1000 mL烧杯中,在70 ℃条件下处理20 min,晾干表面水分后冷冻干燥处理。

以上每个样品做三组平行。利用扫描电子显微镜和图像数字化处理技术评价凝胶结构变化。

1.2.5 检测与评价

1.2.5.1 蛋白酶酶活力的测定 参照福林酚法测定海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活力[7-9]。

反应条件参考1.2.2,反应完成后,加入5 mL三氯乙酸(0.4 mol/L)溶液,终止反应,摇匀后静置离心,分别取1 mL上清液放入3支试管中,加入5 mL碳酸钠溶液(0.4 mol/L)及1 mL福林酚试剂,37 ℃保温显色20 min,利用紫外分光光度计(波长680 nm)测定吸光度,计算酶活力。

酶活力单位定义:一个活力单位(U)为在1 min内催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量。固定化酶活力单位根据载体质量以U/g表示。

1.2.5.2 相对酶活力的计算

式中:E1表示超声条件下固定化木瓜蛋白酶酶活力;E0为非超声条件下固定化木瓜蛋白酶酶活力。

1.2.5.3 定量评价超声对海藻酸钠凝胶结构影响 扫描电镜放大100倍观察1.2.4中所做样品凝胶表面结构。再液氮脆断凝胶膜,扫描电镜放大100倍观察凝胶断面结构。利用专业图像分析软件Image Pro-Plus,测量凝胶膜表面阴暗区的面积和视野观察区面积,凝胶膜表面阴暗区面积与视野观察区面积百分比就是凝胶膜表面的比表面积。测量凝胶膜截面孔隙面积和视野观察区面积,凝胶膜截面孔隙面积与视野观察区面积的百分比就是凝胶截面的比表面积[7]。

1.3 数据处理

每组实验做3次平行,实验结果为3组平行实验数据的平均值。采用DPSv15.10数据处理系统完成均匀试验设计及处理均匀试验数据。采用Image Pro-Plus 6.0专业图像分析软件分析处理扫描电镜图像。数据统计差异比较及分析采用Microsoft Excel 2010及Origin 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 超声频率对海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活性的影响

2.1.1 超声频率对海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活性的影响 图1表示相同超声功率、温度、时间条件下海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶相对酶活力随着超声频率增加的变化趋势。

图1 超声频率对固定化酶相对酶活力的影响Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on the relative enzyme activity of immobilized papain

由图1可知,海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力随着超声频率的增加呈现先增加后减小的趋势。当超声频率为40 kHz时达到最大,相对酶活力为223.24%±9.8%。超声的空化效应可以影响固定化酶凝胶载体的结构、酶的结构、底物分子结构、分子的传质等,空化效应越强,影响越大。一般来说频率增高声波膨胀时间变短,空化核尚未增长到可产生空化效应的空化泡的大小,或者即使空化泡形成但由于压缩时间短,空化泡还来不及收缩至发生崩塌,以致空化效应并不明显,低频时声周期长,空化泡所能达到的最大半径增大,崩溃时更剧烈,但是,频率过低气泡存活时间过长,泡内自由基又很容易互相结合而失去活性,所以在一定的操作参数下有一个合适的频率值,使酶活力达到最大[10]。

2.1.2 超声功率对海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活性的影响 由图2可知,海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力随着超声功率的增加而增加,当功率达到0.45 W/cm2,相对酶活力最大,为301.79%±5.43%。王超等[11]研究发现在135 kHz超声频率条件下,壳聚糖-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶相对酶活力随超声功率的增大先增大后减小,在0.35 W/cm2功率处达到最大值。与本文研究结果不同,分析认为可能原因是,由于超声频率不同或者凝胶载体不同,凝胶强度不同,导致超声对固定化酶影响不同。

图2 超声功率对固定化酶相对酶活力的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the relative enzyme activity of immobilized papain

2.1.3 超声温度对海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活性的影响 由图3知,随着温度的升高,固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力呈先上升后降低的趋势,在50 ℃条件下,相对酶活力最大,为274.67%。从实验结果来看,在较低温度条件下,超声强化固定化木瓜蛋白酶活性对温度变化更为敏感。白鸽等[12]研究发现在40 kHz,0.15 W/cm2超声条件下改性明胶固定化木瓜蛋白酶相对酶活力随超声温度的升高先增大后减小,在40 ℃达到最大值。与本文结果趋势一致。

图3 超声温度对固定化酶相对酶活力的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the relative enzyme activity of immobilized papain

2.1.4 超声时间对海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶酶活性的影响 时间是影响超声强化固定化木瓜蛋白酶活性的一个重要因素。由图4知,随着时间的延长,固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力呈先上升后降低的趋势,时间为30 min时,相对酶活力最大。在选取时间范围内,时间过短,超声对固定化木瓜蛋白酶影响或未达到预期效果;时间过长,固定化酶活力虽仍呈上升趋势,但是超声处理固定化酶的酶活力上升幅度低于非超声条件下的固定化酶,相对酶活力减小,即超声强化效果减弱。实验结果证明,在较短时间条件下,超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性效果更明显。

图4 超声时间对固定化酶相对酶活力的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the relative enzyme activity of immobilized papain

2.1.5 超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性条件的优化 由表2可得，通过均匀试验,采用偏最小二乘回归分析,以固定化酶相对酶活力为指标优化得到当超声频率40 kHz、超声功率0.45 W/cm2、超声时间20 min、超声温度70 ℃时,相对酶活力最佳的超声条件,预测相对酶活力为342.64%,验证试验结果为370.88%±8.24%。

表2 均匀试验结果表Table 2 Results of uniform test

2.2 不同超声条件对海藻酸钠凝胶结构影响

2.2.1 不同超声频率对海藻酸钠凝胶结构影响 由图5、图6知,随着超声频率的增加,凝胶表面粗糙程度先变大后减小,凝胶膜截面孔隙逐渐变得狭长、均匀。由图7知,随着超声频率的增加,凝胶膜表面及截面的比表面积都呈先增大后减小趋势,在超声频率40 kHz处,凝胶比表面积达到最大值。Chen研究发现过高的超声频率产生的空化气泡过大,最终导致空化作用效果的减退[13]。

图5 不同超声频率处理下海藻酸钠凝胶表面的表观形貌(100×)Fig.5 Scanning electron microscope(SEM)of the surface of calcium alginate gels film by different frequency of ultrasound pretreatment(100×)注:(1)非超声条件;(2)28 kHz;(3)40 kHz;(4)50 kHz;(5)135 kHz,图6同。

图6 不同超声频率处理下海藻酸钠凝胶横截面的表观形貌(100×)Fig.6 Scanning electron microscope(SEM)of the cross section of calcium alginate gels film by different frequency of ultrasound pretreatment(100×)

图7 不同超声频率处理下海藻酸钠 凝胶表面与截面的比表面积Fig.7 Effect of ultrasonic frequency on area ratio of alginate gel

比较图1、图7可知,随着超声频率的增大,固定化酶相对酶活力与凝胶比表面积都呈先上升后降低的趋势,在40 kHz处达到最大值。

2.2.2 不同超声功率对海藻酸钠凝胶结构影响 图8、图9分别为海藻酸钠凝胶表面与截面的扫描电镜图,随着超声功率增大,海藻酸钠凝胶膜表面破坏程度增大,截面孔隙增大且越来越均匀,孔隙壁破坏程度增大。对比图10可以看出随着超声功率增加,凝胶的比表面积呈增大趋势,在功率为0.45 W/cm2处达到最大值。随着超声功率的增加,超声的空化效应及机械效应加强,生成的气泡崩裂越剧烈,对凝胶结构影响越大。

图9 不同超声功率处理下海藻酸钠凝胶横截面的表观形貌(100×)Fig.9 Scanning electron microscope(SEM)of the cross section of calcium alginate gels film by different power of ultrasound pretreatment(100×)

图10 40 kHz超声不同功率处理下海藻酸钠 凝胶表面与截面的比表面积Fig.10 Effect of ultrasonic power on area ratio of alginate gel

比较图2、图10可见,随着超声功率的增大,固定化酶相对酶活力与凝胶比表面积都呈上升的趋势,在0.45 W/cm2处达到最大值。

3 结论

本文主要研究超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性与超声对凝胶载体结构影响之间的关系。研究证明超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性与超声对凝胶结构的影响有着密切的联系。随着超声频率增加,海藻酸钠凝胶比表面积及固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力呈先增大后减小的趋势,在40 kHz处达到最大值;随着超声功率的增加,海藻酸钠凝胶的比表面积及固定化酶相对酶活力都呈上升趋势,在0.45 W/cm2处达到最大值。优化试验表明,超声强化海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶活性的最佳条件为40 kHz、0.45 W/cm2、70 ℃、20 min,在此条件下,凝胶比表面积达到最大值。结果表明,不同超声条件对凝胶结构的影响与强化海藻酸钠固定化酶活性的变化结果相一致。凝胶比表面积的增大可能影响酶在凝胶载体中的分布或使反应体系的传质更加容易,酶与底物更容易结合或解除产物抑制作用,强化固定化酶活力。上述研究结果验证了超声强化固定化酶活性与超声对凝胶结构的影响有着密切的联系。

超声影响固定化酶活性是一个复杂的过程,需要进一步研究固定化酶活性位点、底物结构、酶分布、酶结构以及稳定性的影响。

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