酶比色法定量检测乳糜血标本三酰甘油的研究

邓文成 张杰良 黄雪珍 莫和国 黄培坚

作者单位：528415 广东中山，南方医科大学附属小榄医院检验科

三酰甘油（triglyceride，TG）是一项重要的临床血脂常规检测指标，在动脉粥样硬化、糖尿病、脂肪肝与肾病综合征等疾病的监测中都有重要意义［1］。血清TG测定方法一般可分为化学法、酶比色法和色谱法三大类，国内临床实验室大多数采用酶比色法，即甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法（GPO-PAP），该方法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，易于达到终点［2］。但从日常检测工作中发现，酶比色法在检测高浓度TG标本〔如家庭性高甘油三酯血症、家庭性混合型高脂血症（特别是急性胰腺炎高危状态）患者〕时，会出现严重的偏差，导致假性低值结果，从而影响临床诊断与治疗。本研究采用酶比色法定量检测血清浊度指数、反应速率，分析不同浓度样本浊度指数、反应过程吸光度（A）值与实测浓度的变化，同时根据反应监测曲线形状与前带检查（prozone check，PC）报警值识别反应过程中出现的假性低值，从而正确测定样本中TG浓度，报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源 选择低值（L）和高值（H）血清标本各1份，其中L为健康体检者外观清亮血清，TG浓度为0.41 mmol/L；H为急性胰腺炎住院患者高度混浊血清，TG浓度为27.54 mmol/L（稀释后测定值）。

1.2 仪器与试剂 采用Roche Cobas C8000全自动生化分析仪检测样本，TG检测试剂及配套校准品与质控品、血清指数检测试剂均由Roche公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 检测原理 TG在脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）作用下快速全面地水解为甘油，然后在甘油激酶（glycerol kinase，GK）与GPO作用下氧化为磷酸二羟丙酮和过氧化氢（H2O2）。最后在过氧化物酶的催化作用下，反应产生的H2O2与4-氨基比林和4-氯酚反应形成红色染料（Trinder终点反应），红色染料的颜色深浅与样本中的TG浓度成正比。

1.3.2 检测参数 TG检测方法采用1点终点法，主/次波长为505/700 nm，检测时间10 min，仪器共测定并记录38个A值并生成反应监测点与A值反应曲线图；其中第38点A值（A38）用于样本浓度计算，而用于反应速率检测与PC的A值分别为第2、4、10、14点 A值（A2、A4、A10、A14）。PC 在 A 值区间下限为“-3”，上限为“100”，如果PC值落在上下限之外，则检测值出现前带报警“＞Kin”。TG的检测范围为0.1～10.0 mmol/L，检测浓度超出范围上限则报警“＞Test”；此外，如主（次）波长的A值超过检测限值（32 000），则报警“＞Abs”。以上所有检测参数均由Roche公司提供。

1.3.3 PC 与样本浓度计算［3］PC＝〔V（pmp14，pmp10）/V（pmp4，pmp2）〕×100；其 中 V（pmp14，pmp10）＝（A14－ A10）/（14 － 10），为第 10 点与第14点的A值反应变化速率，而V（pmp4，pmp2）＝（A4－ A2）/（4－ 2）为第 2点与第 4点的 A 值反应变化速率。PC启动条件：A4－A2≥3 000。样本浓度计算公式：Cx＝K（Ax－Ab），其中Ax为待测样本A 值（A38），Cx为待测样本浓度，K（770）与 Ab（726）为校准曲线参数（本研究Cx与PC由仪器自动计算并记录）。

1.3.4 血清浊度指数（L指数）［3-4］L指数是仪器测定样本（稀释后的样本）在主次波长660 nm与700 nm处的A值，由公式L＝1/C×A（C＝9）计算所得。血清浊度指数能半定量地反映待检样本的浊度，与样本浊度呈正相关。

1.3.5 系列稀释浓度样本配制与测定 按照“1L，0.95L+0.05H，0.9L+0.1H，0.85L+0.15H，0.8L+0.2H……0.2L+0.8H，0.15L+0.85H，0.1L+0.9H，0.05L+0.95H，1H”，用低浓度样本（L）0.41 mmol/L对高浓度样本（H）27.54 mmol/L进行稀释。将系列稀释浓度样本和分别增量1.5倍、2倍高值样本（H）反应体积获得的2份高浓度样本（41.31 mmol/L、55.08 mmol/L）进行编号（样本1～23），并在仪器上检测，计算系列样本理论浓度，记录血清浊度指数值、反应过程的A值与实测浓度值。

2 结果

2.1 TG系列稀释样本理论浓度、实测浓度、血清浊度指数、A值及对应的PC值结果，见表1。

2.2 TG系列稀释样本理论浓度、实测浓度与血清浊度指数的相关性分析见图1～2，TG系列稀释样本反应时间与A值监测曲线见图3。

图1 样本1～12（A）和样本13～23（B）TG理论浓度与实际浓度的相关性分析

图2 TG理论浓度（A）、实际浓度（B）与血清浊度指数的相关性分析

图3 样本1～23的TG反应监测曲线

3 讨论

从表1与图1～2可知，随着样本中TG理论浓度的增加，L指数、反应过程A值与仪器实测浓度也增加。样本1～8浓度在方法检测范围内（＜10.0 mmol/L），实测浓度与理论浓度的相对偏差较小，结果相关性良好；虽然样本9～12浓度超出检测范围（＞Test），但相对偏差仍然在7%内；而样本13～23的浓度明显超出方法检测上限，实测浓度与理论浓度出现较大的负偏差，偏差最小者为-12.41%，最大者超过-50%，其中样本22（41.31 mmol/L）和样本23（55.08 mmol/L）仪器实测浓度分别为5.93 mmol/L、5.87 mmol/L（偏差分别为-84.0%、-89.3%）。上述结果说明，采用酶比色法定量检测TG时，低浓度（＜15.34 mmol/L）样本的检测结果相关性良好（R2＝0.999 3），相对偏差较小；而高浓度样本（＞16.69 mmol/L）的检测结果相关性较差（R2＝0.864 1），相对偏差（负偏差）较大，实测值与理论值曲线呈明显分离现象，结果呈明显假性低值。

与实测值出现较大的负偏差不同，血清L指数随样本中TG浓度的升高而升高（L指数的检测范围为0～20 000 mg/L），呈持续上升的曲线（同理论值）。根据厂家试剂说明书阐述，L指数与样本浊度有关，与TG水平无关；但表1和图2显示，L指数与TG呈正相关，即随样本中血清浊度和TG浓度的升高，L指数升高。试剂说明书中阐述的L指数和TG浓度之间的相关性较差，可能与厂家性能验证实验中加入外源性脂肪乳剂有关，与患者自身产生的乳糜微粒有本质区别（可能LPL对患者的乳糜微粒水解较好）。因此，通过L指数能够大致判断样本中的脂血程度与TG浓度，浊度指数超过200提示样本浓度过高，而超过400提示样本浓度极高，需对样本进行稀释后再测定。对于使用没有设置PC报警的TG检测试剂的实验室，L指数检测是TG正确定量测定的较好选择。

PC根据监测反应过程中A值的变化判断样本浓度是否达到或超出方法的检测极限，同时根据数据报警判断样本是否为高值。根据PC的检测条件（A4－ A2≥3 000），从样本 4（4.49 mmol/L）开始，仪器就对反应过程进行了PC，直至样本23；尽管样本9～16超出了检测范围上限且执行了PC，但PC值在区间“-3～100”内，所以没有达到前带报警“＞Kin”。由于样本17～23中TG浓度极高，PC值超出本研究的设定区间，因而出现数据报警“＞Kin”（即Kinetic unstable，Prozone错误/运动不稳）；其中样本22和23除“＞Kin”报警外，还因其极高的血清浊度出现了“＞Abs”报警，即主波长A值出现了大于32 000的吸光度限值（反应过程A值的最大值分别为43 936、38 064），提示样品浓度过高或样品脂血。

图3为样本1～23的反应过程时间与A值监测曲线。其中，TG浓度在方法检测范围内的样本1～8的反应曲线呈上升变化明显的平滑曲线，反应终点A值（A38）随TG理论浓度的升高而升高，根据计算公式Cx＝K（Ax－Ab），在K值与Ab值不变的情况下，TG实测浓度也按一定比例明显升高，实测值与理论值相关性良好。TG浓度超出方法检测范围上限的样本9～16的反应监测曲线相对平滑，但上升变化不明显，而且浓度越高，上升幅度越小；图中样本13～16的反应曲线已基本重叠，反应终点A值（A38）几乎无变化，根据计算公式，TG实测浓度也变化不大，稳定在14.62～14.75 mmol/L，显示反应过程已达到饱和状态。随TG浓度（浊度）的继续升高，样本17～23的反应曲线开始出现不规则变化；其中，样本17～20的反应曲线中A11～A20的A值不但没有升高，反而出现了小幅度的下降；而样本21～23的反应曲线更不规则，反应过程A值变化极不稳定，从A12开始A值出现更为严重的下降倾向，浓度越高下降幅度越大，直至反应终点才有部分回升；根据反应终点A值及其计算值，TG实测浓度也会出现下降的低值结果。出现上述结果的原因可能为检测浓度在超出检测上限并达到饱和状态下，若样本浓度继续升高，检测方法会出现如“底物耗尽（ATP，4-氨基比林和4-氯酚）”与“缺氧（O2、H2O2）”等现象，从而导致反应过程A值变化不稳定及出现错误的结果。样本22、23可能由于样本浓度与浊度过高，主波长A值超出仪器设定的吸光度限值（＞32 000），尽管其A38不低（分别为15 936、15 783），但因在浓度值计算时，需在计算公式Cx＝K（Ax－ Ab）基础上再减去样本空白（7 472、7 475），因而出现了明显假性低值（5.93 mmol/L、5.87 mmol/L），甚至可能出现“正常值”［5］。

TG升高与动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病微血管并发症、肾病综合征等疾病风险密切相关，而高甘油三酯血症还可诱发急性胰腺炎［6］。目前大多数临床实验室采用的TG检测方法对低浓度标本的检测性能良好，但检测高浓度和极高浓度标本（乳糜血）时则出现明显的假性低值。因此，能否正确识别测定过程中的“底物耗尽”与“缺氧”引起的假性低值，直接关系到检测结果的准确性，进而影响临床诊断与治疗。本研究采用血清浊度指数、反应速率法PC技术，通过观察L指数值、反应监测曲线变化和反应过程中有无前带报警，可有效识别反应过程中存在的“底物耗尽”与“缺氧”，并能够迅速、准确地定量测定样本的TG浓度，尤其是乳糜血标本的TG浓度。对出现血清浊度指数较高、超出方法检测上限、PC报警或超出A值限值的结果，可以通过仪器上的自动稀释功能对样本进行稀释重测或采用手工合理稀释后正确测定样本中分析物浓度。

此外，临床常用的生化检验项目如丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）［7］、肌酸激酶（creatine kinase，CK）［8］、免疫球蛋白 G（IgG）［9］、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）［10］等，在检测高浓度样本时也可能存在如“底物耗尽”“钩状效应”等引起的假性低值甚至“正常值”现象。因此，临床实验室工作者应高度重视检测中高剂量分析物引起的“底物耗尽”和“钩状效应”对分析结果的影响，尽量避免反应体系中存在假性低值，切实提高检测结果的准确度，为临床提供准确可靠的诊断数据。