食品中脂肪酸分析方法的研究进展

方景泉，迟涛，王菁华，徐欣

(1.国家乳业工程技术研究中心黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨 150028；2.黑龙江省科学院火山与矿泉研究所 五大连池 164155；3.黑龙江立高仪器设备有限公司，哈尔滨 150028)

0 引 言

脂肪酸根据碳链长度的不同可将其分为短链脂肪酸（SCFA）、中链脂肪酸（MCFA）和长链脂肪酸（LCFA）；根据饱和度的不同可分为饱脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）。在多不饱和脂肪酸中，根据第一个双键距离甲基端数目的不同主要分为ω-3系（α-亚麻酸、EPA、DHA等）和ω-6系（亚油酸、γ-亚麻酸和花生四烯酸等）[1]；根据几何异构体的不同可分为顺式脂肪酸和反式脂肪酸，双键两侧的两个H原子位于碳链的同侧则为顺式，位于异侧为反式[2]脂肪酸。

食品中的脂肪酸一般不能单独存在，大部分以甘油三酯的形式存在于食品中，我们对食品中的脂肪酸进行分析，需要将脂肪酸从食品中提取分离出来。国内外对脂肪酸的分析研究方法很多，如常见的薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法以及最近几年发展起来的傅里叶红外光谱法和核磁共振法等。这些分析方法适用范围不同，且各有优缺点。本文在总结前人研究的基础上，结合近几年研究动态，综述食品中脂肪酸的检测方法，比较它们的优缺点，方便科研人员选择合适的脂肪酸测定方法。

1 气相色谱法（GC）在脂肪酸分析中的应用

1.1 气相色谱法

气相色谱法是脂肪酸分析方法中应用最广泛的方法，是美国食品和药物管理局（FDA）推荐使用的方法。GC利用极性色谱柱分离不同碳链长度的脂肪酸，通过FID检测器进行定性定量分析。保留时间与脂肪酸碳链长度、不饱和度和双键几何构型的差异及气相色谱柱的涂层有关。

气相色谱是我国测定脂肪酸的国家标准方法[3-6]，研究论文很多，互相之间大同小异，由于基质和色谱柱分离特性的不同，得到不同脂肪酸方法学参数。吕晶等[7]采用以氰丙基聚硅氧烷为固定相的SP-2560强极性毛细管色谱柱分析脂肪乳剂中的脂肪酸，C18∶1、C18∶2、C18∶3反式脂肪酸与邻近的顺式脂肪酸分离完全，检出限3.10～6.37μg/mL，平均回收率95.7%，RSD1.81%（n=6）。丁双等[8]十七烷酸甲酯为内标，以聚乙二醇为固定相的INNOWAX毛细管柱和FID检测器检测结构脂质中脂肪酸的组成。脂肪酸甲酯的回收率在94.53%～96.02%之间，标准差0.0077%～0.0514%，变异系数0.70%～1.64%（n=6），该方法快速准确，有较好的重现性和有效性，适于测定基质中脂肪含量较高的样品。刘冬豪等[9]等采用乙酰氯-甲醇甲酯化处理方法，以固定相为88%-氰丙基-聚硅氧烷的HP-88色谱柱分离，以十一碳酸甘油三酯为内标进行定量，建立了测定配方奶粉中的脂肪酸和反式脂肪酸的气相色谱分析方法。顺-反异构体脂肪酸分离效果较好，优于国家标准（回收率97.2%～104.6%，标准偏差小于3.5%，检出限为5μg/mL）。这些方法，采用了三类色谱柱，其中SP-2560和HP-88针对脂肪酸做了专门的优化，测定效果较好。

GC测定脂肪酸的方法包含在美国公职分析化学师协会（Association of Official Analytical Chemists,AOAC）推荐测定脂肪酸的AOAC994.14，AOAC994.15和AOAC996.4中。也是官方测定的标准方法。近年来，国外关于GC测定脂肪酸的研究多对现有的GC测定方法进行了改进或以GC测定方法为基准开发其他方法。Kail[10]等采用选择性甲酯化方法测定甘油三酯和脂肪酸，在前处理中采用不同的甲酯化试剂以及不同的甲酯化反应条件，增加了结构相似脂肪酸在色谱柱上分离效果，对于分析特殊脂肪酸具有一定的指导意义。Nunome[11]等采用乙酯化方法，快速测定人汗液中的脂肪酸，18个碳以下的脂肪酸测定效果较好，这种方法的特点在于采用GC测定了中短链脂肪酸及GC擅长的短链脂肪酸。Filipek[12]等比较了相色谱和毛细管电泳测定脂肪酸的结果，气相色谱的分离度，优于毛细管色谱。其他不同基质中脂肪酸测定的方法如下：Simionato[13]等分析了乳品中的脂肪酸，Jiang[14]等测定厌氧消化物中的长链脂肪酸，回收率均在80%～108%之间，检出限6 mg/kg，变异系数0.70%～1.54%（n-12）。

综上所述，气相色谱法分析除短链以外的脂肪酸，均具有检测不确定度小，检测结果重现性好的优点。气相色谱设备成本低，维护简单，易于普及应用。但是这种方法前处理麻烦，需进行脂肪提取，甲酯化或乙酯化，然后才能上机测定。脂肪酸甲酯化过程中，容易导致不饱和脂肪酸发生氧化，使测定结果偏低。

1.2 气相色谱和质谱联用

随着现代分析仪器的普及，近年来利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行脂肪酸测定的研究也越来越多。质谱技术具有强大的化学结构解析功能，无需标准品即可通过特征离子比对质谱库准确定性，具有灵敏度高、稳定性好的优点[15]。楼乔明等[16]采用GC-MS测定孔石莼脂肪酸组成，对饱和脂肪酸甲酯、单不饱和脂肪酸甲酯和多不饱和脂肪酸甲酯的裂解规律和质谱特征进行了分析归纳。鉴定出孔石莼中24种脂肪酸。表明特征离子在脂肪酸甲酯尤其是多不饱和脂肪酸甲酯的定性方面具有很好的应用价值。薄海波等[17]利用GC-MS分析鱼油中的脂肪酸，在有的脂肪酸有杂质干扰的情况下，仍从鱼油中鉴定出47种脂肪酸，包括直链、单支链、多支链饱和脂肪酸，单不饱和、多不饱和脂肪酸，环丙烷基、呋喃基脂肪酸等。单纯采用GC无法得到这些信息。吴惠勤等[18]利用索氏提取法提取食品中的脂肪，经甲酯化后，采用GC-MS法测定分析，通过质谱断裂规律，利用特征离子鉴定脂肪酸成分，快速确定了脂肪酸顺反异构体及不饱和脂肪酸双键数目。这些测定方法的开发，均充分利用了质谱分辨性好、定性准确的优点。

国外开发质谱测定应用较早，近年来的研究报告大多采用了超临界、固相微萃取等新的脂肪提取技术或新的提取溶剂，对质谱条件优化不多。Lv[19]等综合溶剂残留提取脂肪的方法，测定了食品包装膜中的脂肪酸酰胺，检出限 61.0 ng/g～103.0 ng/g。Yue[20]等测定了铁棒锤酒精提取物中的脂肪酸，Zhang[21]等利用超临界二氧化碳提取测定鲶鱼中的脂肪酸，检出限2.2-20.0 mg/L，定量限 7.39-59.85 mg/L，回收率90.0%～111.2%。Roehsig[22]等通过固相微萃取测定了鸦片中的脂肪酸乙酯，检出限100 ng/g，定量限150 ng/g。GC-MS另外一个应用是利用测定出的脂肪酸进行分类识别，目前较为成熟的应用是测定微生物中脂肪酸的组成对微生物进行分类，已经有成熟的微生物脂肪酸整合测定仪器出现。类似的，Horj[23]等测定不同鲤鱼品种中的脂肪酸组成，反推鱼的种类，通过脂肪酸识别鱼品种，这也许是脂肪酸分析的另外一种应用。

GC-MS的灵敏度高于气相色谱法灵敏度，是脂肪酸分析的一种重要工具。利用GC-MS分析食品脂肪酸时，无需昂贵的标准品，根据质谱特征离子就可确定脂肪酸组成。GC-MS的定量采用特征性离子进行定量，检出限高，定量下限低，但标准偏差较大。表1列举了2006年以来采用气相色谱分析脂肪酸的重要文献。

2 高效液相色谱法(HPLC)在脂肪酸分析中的应用

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱在常温和低温下就可实现物质的分离，对高温不稳定的高度不饱和脂肪酸和沸点较低的短链脂肪酸分析效果更好[24]。国内采用HPLC分离测定脂肪酸的研究比采用气相色谱少，且2009年后没有报道出现。说明目前高效液相色谱法已经基本不用来测定脂肪酸。黄于娟等[25]利用HPLC法，采用Hyperil BDS C18色谱柱和紫外检测器（UV，波长为252 nm）测定母乳中的多不饱和脂肪酸（PUFA），α-亚麻酸、DHA、AA和亚油酸完全分离，平均回收率98±5%，提取回收率均≥75%。吴丽芹等[26]用反相色谱配合紫外吸收检测器测定卵磷脂结果稳定性、重复性都较好，相对标准偏差小于5%，加样回收率121%。钟南京等[27]对比了反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器和正相高效液相色谱-示差检测器两种检测方法对，两种方法均能定量分析甘油一酯（MAG）、甘油二酯（DAG）及甘油三酯（TAG）的相对含量。赵海珍等[28]用ZORBAX SB C18色谱柱分析猪油甘油三酯中的脂肪酸组成及其位置分布。李一哲等[29]采用超高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定生物柴油中常见的脂肪酸及脂肪酸甲酯。

表1 气象色谱法测定脂肪酸重要文献（2006年至今）

近年，国外研究液相色谱测定脂肪酸的同样文献较少，大多在测定中采用新的提取技术或特殊的前处理方法。Wang[30]等采用超流体提取技术提取脂肪，液相色谱测定了豆蔻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、亚麻酸甲酯、硬脂酸、亚油酸甲酯、棕榈酸甲酯、油酸甲酯、芥酸和硬脂酸甲酯，回收率87%～103%，检出限0.6 ng/mL。Dias[31]采用离子排斥色谱测定短链脂肪酸，线性范围0.025～10 mmol/L，线性范围内相关系数0.9985～0.9999。Raza[19]等测定菜籽油中必须脂肪酸含量，线性范围0.05～10.12 mmol/L。Guo[32]等采用蒸发光检测器测定长链脂肪酸，取得的结果与Raza类似。

这些研究的稳定性、精确性及回收率虽然也在测定方法学允许范围内，但低于气相色谱法。这是HPLC测定脂肪酸研究越来越少的主要原因。但液相色谱测定短链脂肪酸，如乙酸、丙酸及丁酸等水溶性脂肪酸具有优势，而这几种脂肪酸采用气相色谱难以测定。

2.2 HPLC-MS联用技术

HPLC-MS比单独HPLC灵敏度高，而且能够提供脂肪酰基离子、单酰基甘油离子及二酰基甘油离子的质量特征，使其能够准确判断甘油酯类型、脂肪酸组成及其位置分布[24]。近年来国内外研究报道较多，主要是开发同时测定多种脂肪酸的方法或利用质谱的高通量特点进行组学研究和分析。许倩等[33]采用液相色谱-质谱联用法测定了血液中的游离脂肪酸的含量，使用Dole提取，提取的样品直接进行分析，不需要衍生化处理，以氘代十六烷作为内标物。各脂肪酸线性方程的相关系数均大于0.99，方法的回收率为90.02%～100.05%，相对标准偏差小于9%。朱芳等[34]用高效液相色谱-质谱，在Eclipse XDB-C8色谱柱上进行梯度洗脱，采用大气压化学电离（APCI）正离子模式，实现了油菜蜂花粉中20种游离脂肪酸的质谱鉴定。所有脂肪酸的线性相关系数均大于0.9999，检出限 24.76～98.79 fmol。赵先恩等[35]同样利用 XDB-C8色谱柱上分离了19种游离脂肪酸，大气压化学电离源正离子模式，绝大多数脂肪酸的线性相关系数大于0.9996，检出限12.3～43.7fmol，低于朱芳的检出限。丁养军等[36]采用HPLC-MS分离鉴定深海鱼油中长链不饱和脂肪酸，利用不饱和脂肪酸的分子离子峰和特征碎片离子峰的质量数，推算出不饱和脂肪酸的双键位置，这为确定不饱和脂肪酸双键位置提供了新的技术方法。其他可供参考的测定方法除了基质不同，其他大同小异，但线性范围不同，这不仅与基质有关，还与质谱的分辨率和优化的条件有关。Koriyama[37]等利用液相色谱柱飞行时间质谱测定食用油里的葡萄糖酸甲酯等系列脂肪酸，相对变异系数低1.7%,检出限0.22 ng/mL，回收率62.6%～108.8%。Chu[38]等测定蚯蚓中的游离的脂肪酸，以13碳脂肪酸为内标，回收率96%～103%，检出限在26～78 ng/mL之间。Kotani[39]等测定人类和小鼠粪便中的短链脂肪酸，线性范围0.1～40 nmol，变异系数小于2.7%（n=5）。Hellmuth[40]等采用超高效液相色谱-四级杆质谱联机研究对人血浆进行了脂质组学研究，获得36种脂肪酸的信息。Song[41]等联用荧光检测器和质谱检测器测定锡金籽油中的脂肪酸，检出限0.21-0.99 mg/L。

HPLC-MS分析脂肪酸将高效的HPLC分离和高灵敏度的MS检测结合起来，成为分析脂肪酸的一种简捷手段。具有分离效果好、应用范围广、精密度高、分离速度快等特点，目前越来越多的应用到各种食品分析中。质谱法更适合高通量同时分析多种脂肪酸，尤其适合脂质组学研究。相关的文献总结见表2。

3 薄层色谱（TLC）法在脂肪酸分析中的应用

TLC法最早应用于脂质分析，能够将甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯及其游离脂肪酸有效的分离开。不同脂质由于极性不同及硅胶的吸附能力不相同，在通过对比，可用于对松籽油中γ-亚麻酸进行工艺质量控制。Chattopadhyay[46]等和 Estévez[47]等采用 TLC分离生物柴油中的脂肪酸以供气相色谱质谱分析。

TLC法具有直观、快捷的优点，能快速分离，而且比较经济，可以用于油脂产品加工过程中快速的工艺质量控制。TLC法需要样品量大，测定的灵敏度和分辨率都很低，而且存在分离的不饱和脂肪酸易氧化和显色反应受杂质干扰的问题。

4 二维色谱法测定脂肪酸

近年来采用多维色谱分析脂肪酸的报道逐年增多。郑月明等[48]采用全二维气相色谱-四极杆质谱分硅胶板上分离。脂质在TLC上展开后，通过显色剂（碘蒸气、Dittmer-Lester钼蓝、Dragendorff试剂、Vaskovsky试剂和茚三酮等）显色，通过薄层色谱扫描仪扫描计算积分值定量或将斑点刮下测定其含量。目前国内外极少利用TLC测定脂质的研究，更多的是利用TLC作为色谱测定脂质的前处理，经过TLC初步分离后用GC、HPLC、GC-MS或HPLC-MS做进一步的分析[42]。黄缘等[43]采用薄层色谱法测定脂肪乳注射液及卵磷脂中溶血磷脂酰胆碱（LPC），结果样品中LPC斑点与其他磷脂斑点分离良好，LPC在0.4～10μg范围内线性良好，线性相关系数0.9997，平均加样回收率为9.4%，RSD=2.1%。李晓陆等[44]采用AgNO3-硅胶和尿素-硅胶薄层色谱分离植物油脂肪酸甲酯，发现亚油酸甲酯、油酸甲酯、饱和脂肪酸甲酯能够很好的分开，该方法可快速直观的分离脂肪酸甲酯，但准确度和精确度不够。陈雅等[45]采用薄层色谱和气相色谱分别鉴别松籽油中γ-亚麻酸，TLC法斑点清晰，析方法，以DB-1柱作为一维柱、DB-Wax作为二维柱进行分离，分析了植物油脂中31种脂肪酸成分，脂肪酸在50 min内得到准确和灵敏的检测，作者认为该法比气相色谱-质谱法的灵敏度提高了100倍以上，是脂肪酸成分的分析新技术手段。金静等[49]以UF-IMS毛细管柱作为第一维柱、UF-mFFAP毛细管柱作为二维柱，搭建二维气相色谱-质谱，测定地沟油中奇数碳脂肪酸、不同碳数烷酸及同碳数烷酸异构体，测定效果与郑月明等类似。国外未见二维气相色谱-质谱检测食品中脂肪酸的报道，Lissitsyna[50]利用和金静类似的色谱柱组成二维气相色谱-质谱，检测了航空油中的脂肪酸组成，结果较好（回收率100%，检出限2.5μg）。Hejazi[51]等创造性的利用极性色谱柱和场域质谱组成二维色谱，分析鱼油、菜籽油中的脂肪酸，获得和但获得的方法学参数一般，且分析较为复杂。

表2 液相色谱法测定脂肪酸重要文献(2005年至今)

多维色谱与常规的单色谱相比，具有更高的选择性、更大的峰容量和更好的分辨率，并且其进样量大、灵敏度高、分析速度快，适合对大量样品做痕量分析。但其方法的建立比较繁琐耗时，且目前成熟方法不多。需要进一步开发多维色谱分析食品脂肪酸的方法。

5 其他技术

红外光谱(infrared spectrum,IR)测定食品中的脂肪酸，测定速度快，但定性定量的精确度不够，近年来研究文献有逐渐增多的趋势。研究人员应用傅里叶变换红外（Fourier transform near-infrared,FT-NIR）光谱技术分析食品中含量较低的脂肪酸，符合方法学要求。陶健等[52]采用FT-NIR光谱测定食品中的反式脂肪酸，通过反油酸标样在特定波段的吸收光谱，构建定标方程，测定样品中的反式脂肪酸含量，相关系数为0.9997，样品检出限为0.27%，回收率78.06～112.65%。于修烛等[53]比较了FT-NIR和标准IR分析测定食用油中反式脂肪酸含量，FT-NIR法测得的反式脂肪酸含量与实际加入量线性相关好，线性回归方程的斜率为1.02，标准差小于0.05（n=6），比标准红外光谱法灵敏度高。Azizian[54]对比了GC和FT-NIR测定食用油中脂肪酸的结果，一致性较高，认为FT-NIR是一种价效比较高的、潜在的测定单不饱和脂肪酸、反式脂肪酸和多不饱和脂肪酸的方法。Vongsvivut[55]利用FT-IR定量测定鱼油微胶囊中的脂肪酸组成，在测定ω-3脂肪酸时，获得极好的相关系数(R2＞0.99)和较大的线性范围。Song[56]等，Rohman[57]等、Yu[58]等，Rohman[57]等测定油脂中的脂肪酸，优化了扫描频率后，都获得了符合方法学要求的结果。

近年来，核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）技术也应用到脂肪酸测定中。Siciliano[59]等利用高解析度氢谱NMR定量测定猪肉中的脂肪酸链组成，测定出猪肉中的脂肪酸链主要是油酸和多不饱和脂肪酸，作者认为，该法同样能够测定干基肉制品中脂肪酸链的组成。目前，像Barison[60]等比较NMR和AOAC推荐方法的文献比较少，不清楚NMR在一般食品基质中的适用范围。Barison等的研究结果表明，NMR能够满足测定食用油中脂肪酸的定性定量要求。

X射线和拉曼光谱目前在测定脂肪酸中也有应用。Sitko[61]等采用X射线测定了生物柴油中的脂肪酸甲酯。Materny[62]等采用拉曼光谱测定了橄榄油中游离脂肪酸的比例。这些方法同样没有与GC方法进行对比研究，应用性不强。

上述几种测定技术中，傅里叶红外光谱是近几年迅速发展起来的一种测定食品脂肪酸的分析方法，该方法具有特征性强、测定速度快、不破坏试样、试样用量少、操作简便、能分析各种状态的试样等优点，并且克服了传统红外光谱需要甲酯化、使用有毒溶剂等缺点。是未来比较有前途的一种脂肪酸测定方法。

6 未来发展趋势

综上所述，薄层色谱现在只用在气相色谱和液相色谱的前处理阶段，目前已无单独分析脂肪酸的报道，但可用于油脂产品的工艺质量控制。气相色谱是目前脂肪酸分析的主要方法，能够对大部分脂肪酸定性定量分析，但部分同分异构的脂肪酸在气相色谱上不能完全分离，同时测定多种脂肪酸难度较大。高效液相色谱法目前主要用于短链脂肪酸和特殊脂肪酸的检测。色谱与质谱联用法具有很强的结构分析功能，不需要标准品就能够对样品进行准确的定性分析。目前气相色谱质谱应用较多，是仅次于气相色谱测定脂肪酸的方法。液相色谱质谱法常用于同时测定多种脂肪酸或进行脂质组学研究，是进行脂质研究的主要方法。傅里叶红外光谱、核磁共振法测定脂肪酸近几年新兴的检测方法，正逐步应用到食品的检测分析中。傅里叶红外光谱测定脂肪酸潜力较大，相比色谱法，检测快，未来将会作为快速测定脂肪酸的主要方法。