羟基红花黄色素对博莱霉素致间质性肺病小鼠的作用机制研究*

王 英 ，孙宇鹏 ，张 伟

（1.山东中医药大学，济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，济南 250011）

间质性肺病（ILD），又称弥漫性实质性肺病（DPLD），是一组以肺泡壁炎细胞浸润和纤维化改变为基本病理表现的肺部疾病的总称。其中特发性肺间质纤维化（IPF）是一种病因仍不明确，并且病情进行性加重，主要病理表现为纤维化伴蜂窝状改变，占特发性间质性肺炎（IIP）的 60%-70%[1]，IPF 治疗指南中强不推荐糖皮质激素等治疗，尼达尼布和吡非尼酮被推荐用于IPF的治疗[2]，其发病率逐年增加，5 a生存率低导致、治疗药物局限导致IPF成为临床治疗难题。针对以上临床治疗间质性肺病的现状及观察近年来中医中药治疗本病的进展，结合活血化瘀类中药治疗间质性肺病的临床研究，选取红花单味药治疗间质性肺病，并进行对比研究，通过气管内博莱霉素（BLM）建立间质性肺病小鼠模型，分析中药红花的提取物红花黄色素对间质性肺病的作用机制，力争进一步研究活血化瘀类药物红花在治疗间质性肺中的作用机制，为中药治疗本病提供新的思路。

1 材料

注射用红花黄色素注射液（购自山东中医药大学附属医院）；BLM（购自合肥博美生物科技有限责任公司，货号：LB3051）；低分子量肝素钠注射液，购自齐鲁制药有限公司，货号：H20030429；TRNzol总RNA提取试剂，购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP405-02；ROX plus，购自 TaKaRa，货号：RR82LR；小鼠白介素（IL）-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，产品编号：EK0411。TGF-β1 ELISA检测试剂盒，购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGEHC107b-1；CTGFELISA 检测试剂盒，购自上海超研生物科技有限公司，货号：SEA010HU。

2 方法

2.1 动物 KM小鼠90只（山东省实验动物中心提供，动物生产许可证号SYXK（鲁）201400007号），鼠龄为8周龄，体质量为18～22 g。随机分为对照组、模型组及红花黄色素组3组，每组为30只。模型组和红花黄色素组予BLM诱导小鼠肺纤维化，建立雄性间质性肺病小鼠模型，对照组以生理盐水代替；实验开始后第21天，随机取3只小鼠解剖，第28天解剖全部小鼠，取肺组织，结束实验，其中第21天、第28天取右下肺分别做病理切片；第28天取左下肺叶用ELISA法测定TGF-β1、IL-6；第28天取右中上肺叶应用实时定量荧光PCR（RTPCR）法检测血管内皮生长因子（VEGF）和内皮细胞型纤溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）的表达。

2.2 组织处理 处死小鼠后取出肺组织于10%中性甲醛中固定，经脱水、包埋制成蜡块并制作病理切片，Masson染色观察。

2.3 ELISA法检测各组小鼠肺组织中TGF-β1、IL-6含量 取小鼠完整左下肺脏，用预冷的生理盐水清肺脏，无菌纱布擦拭，称质量，在冰盘上剪碎，按照每克肺组织加10 mL生理盐水，在冰浴条件下用组织匀浆机以15 000 r/min的转速研磨，制成肺匀浆，离心后取上层清液，采用ELISA法测定IL-6以及TGF-β1的含量。

2.4 Real Time PCR方法检测VEGF和PAI-1 mRNA的表达 取小鼠完整右上、中肺叶，用生理盐水冲去肺脏表面的组织和血污，储存于-80℃冷冻柜中，提取RNA，进行逆转录，应用RT-PCR方法检测VEGF和PAI-1的表达。实验操作严格按产品说明书进行。

表1 引物序列及PCR产物大小

2.5 统计分析 使用SPSS 24.0软件进行数据处理，连续变量用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett’s T3法。P＜0.05说明差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠肺组织病理学改变 空白组肺内结构清晰正常，未见炎性浸润，无充血以及纤维组织增生，肺泡腔内无明显渗出。模型组肺泡结构破坏、融合严重，肺泡腔内存在大量炎性浸润，纤维组织增生明显，后期较前期损坏明显。红花黄色素组间质毛细血管充血、水肿，存在炎性细胞浸润，部分肺泡肺泡融合、闭陷，纤维组织轻度增生。

图1 光镜下经Masson染色肺组织病理表现

3.2 ELISA法检测各组小鼠肺组织中TGF-β1、IL-6含量 与空白组比较，模型组小鼠肺组织TGF-β1、IL-6含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，注射用红花黄色素组小鼠肺组织TGF-β1含量明显降低（P＜0.01），IL-6 含量降低（P＜0.05），见表 2。

表2 各组小鼠肺组织中TGF-β1、IL-6表达含量（s，n=30）pg/mL

表2 各组小鼠肺组织中TGF-β1、IL-6表达含量（s，n=30）pg/mL

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n TGF-β1 IL-6的浓度模型组 30 125.79±20.98** 74.61±11.96**红花黄色素组 30 91.13±21.28## 64.41±10.03#对照组 30 73.27±22.02 49.97±10.76

3.3 RT-PCR法检测各组小鼠肺组织中PAI-1、VEGFmRNA的表达水平 与空白组比较，模型组小鼠肺组织PAI-1、VEGF mRNA表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，注射用红花黄色素组小鼠肺组织VEGF表达水平明显降低（P＜0.01），PAI-1表达水平无差异，见表3。

表3 各组小鼠肺组织中PAI-1、VEGF mRNA的表达水平（±s，n=30）注：与对照组比较：*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

4 讨论

近些年来临床观察及研究表明中医药治疗本病存在优势，获效显著，但治疗机制的实验研究仍不全面。活血化瘀药，性味以辛、苦、温为主，辛能散、行，苦则通泄，且入血分，所以活血化瘀药可行血活血，通畅脉络，消瘀散滞。红花是一味传统的活血祛瘀中药，本文通过实验研究，应用中药红花的提取物红花黄色素治疗博莱霉素所致间质性肺病小鼠，从相关基因表达及细胞因子等角度进行分析，检测 TGF-β1、IL-6、PAI-1、VEGF 等各项指标[3-6]。

本实验研究中，与空白组比较，模型组小鼠肺组织 TGF-β1、IL-6、PAI-1、VEGF mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，红花黄色素组小鼠肺组织 TGF-β1含量明显降低（P＜0.01），IL-6含量降低（P＜0.05），红花黄色素组小鼠肺组织VEGF表达水平明显降低（P＜0.01），PAI-1表达水平无差异，红花黄色素治疗组小鼠各项指标总体优于模型组小鼠，具有统计学意义（P＜0.05），提示中药红花的提取物红花黄色素可以在治疗间质性肺病中通过多途径延缓病情发展。本实验为进一步研究红花治疗间质性肺病提供理论基础。