萝卜硫素对人结肠癌HT-9细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

朱 涛，张吉桂

（1.恩施土家族苗族自治州中心医院消化内科，恩施 445000；2.恩施土家族苗族自治州中心医院内镜中心，恩施 445000）

萝卜硫素（SFN）主要提取于十字花科蔬菜中的一种异硫氰酸酯类活性物质，包括西兰花、花椰菜及甘蓝菜等[1]。近年来较多的报道阐述了萝卜硫素可以预防、延缓及逆转肿瘤发生之前的病理改变，并且对抑制多种肿瘤细胞增殖表现出较好的药理作用[2-5]，也许会成为临床上常用的抗肿瘤药物。结肠癌是发生发展在结肠部位的一种常见消化道恶性肿瘤，其发生率在消化道恶性肿瘤中占据第3位[6]。流行病学调查发现，结肠癌在中国的发病率和病死率每年呈上升趋势，达到或超过了西方发达国家的水平[7]。研究发现，磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路对肿瘤细胞的增殖、分化及和化疗敏感性起着重要的作用，并且结肠癌细胞中PI3K/Akt的异常激活参与了结肠癌的启动[8-9]。然而，有报道阐述萝卜硫素可以通过抑制PI3K/Akt信号通路活化而改善细胞氧化应激损伤[10]，因此，笔者探讨PI3K/Akt信号通路在萝卜硫素诱导结肠癌细胞（HT-9）凋亡中的作用。

1 材料及方法

1.1 材料 人结肠癌细胞株HT-9（美国ATCC公司）；萝卜硫素（上海宝曼生物科技有限公司，批号：4478-93-7，纯度≥99%）；DMEM培养基及0.25%胰酶（上海谷歌生物有限公司）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号：110524）；CCK8增殖和毒性检测试剂盒（江苏碧云天生物科技研究所，批号：WH1175）；PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物有限公司，批号：KGA106）；BCA蛋白测定试剂盒（上海威奥生物科技有限公司，批号：WB0123）；SDS-PAGE试剂盒（武汉谷歌生物有限公司，批号：P1320）；兔抗人PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2 及 β-actin 等多克隆一抗（英国Abcam公司），HRP标记山羊抗兔IgG（武汉谷歌生物科技有限公司）。

1.2 细胞培养与药物处理 HT-9细胞用DMEM完全培养基进行培养，包含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，然后置于37℃、5%CO2的恒湿培养箱中进行培养。待细胞生长至培养瓶底的90%左右时便可进行消化传代培养。然后取对数生长期的细胞接种于96孔板或6孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度的萝卜硫素（10、20、40 mg/L）处理细胞，再继续后续实验。

1.3 CCK8实验检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的HT-9细胞制备成悬液，然后以1×104/孔细胞数接种于96孔板中，培养过夜后，吸尽旧培养基，然后加入含不同浓度萝卜硫素（10、20、40 mg/L）的新鲜培养基继续孵育处理24、48、72 h后，除去板内培养基，然后每孔加入含10 μL CCK8试剂的无血清培养再继续孵育1 h，酶标仪于540 nm波长处检测每孔的吸光度值。

1.4 IP染色观察细胞凋亡情况 取对数生长期的HT-9细胞制备成悬液，然后以1×105/孔细胞数接种于6孔板中，培养过夜后，吸尽旧培养基，然后加入含不同浓度萝卜硫素（10、20、40 mg/L）的新鲜培养基继续孵育处理24 h后，除去板内培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞3次，加入不含EDTA的胰酶进行消化收集细胞，再用PBS清洗细胞3次，5 000 r/min离心6 min，收集细胞。然后将细胞重悬后加入5 μL PI混匀，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western Blot检测蛋白表达 取对数生长期的HT-9细胞制备成悬液，然后以1×105/孔细胞数接种于6孔板中，培养过夜后，吸尽旧培养基，然后加入含不同浓度萝卜硫素（10、20、40 mg/L）的新鲜培养基继续孵育处理24 h后，收集细胞裂解，检测蛋白浓度，然后每孔以50 μg蛋白量上样进行凝胶电泳分离，电压设置为70 V；待分离完成后进行转膜，电流设定为275 mA、时间为70 min。接着将膜放入5%脱脂奶粉中封闭1 h，孵育一抗过夜，用TBST洗膜3次后室温条件孵育对应二抗1h，再次洗膜3次，便可进行蛋白表达分析。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析检验，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 萝卜硫素抑制HT-9细胞增殖 不同剂量的萝卜硫素作用HT-9细胞24、48、72 h后，用CCK8试剂对HT-9细胞的增殖情况进行评估。无论药物作用细胞的时间有多久，HT-9细胞增殖抑制率相对于对照组均显著升高（P<0.05）；而且随着药物剂量的升高，细胞增殖受到的抑制效果更为显著，表现出一定的剂量依赖性。除此之外，还评价了萝卜硫素作用不同时间后对细胞增殖的影响，结果表明随着作用时间的延长，细胞的增殖抑制率明显升高，组间两两比较均有统计学差异（P＜0.05）。见表1。

2.2 萝卜硫素对HT-9细胞凋亡及细胞周期的影响 不同剂量的萝卜硫素作用HT-9细胞24 h后，采用流式细胞仪对细胞的凋亡情况进行评估。随着药物剂量的升高，细胞凋亡率也随之显著上升，呈现出一定的剂量依赖性。药物组中细胞的凋亡率均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同剂量药物组间两两比较发现，它们之间的细胞凋亡率均表现出统计学差异（P＜0.05）。萝卜硫对HT-9细胞周期的影响，提示萝卜硫素可以让HT-9细胞停留在G0/G1期，诱导其凋亡。见图1，表2，表3。

2.3 萝卜硫素对凋亡蛋白的影响 不同剂量的萝卜硫素作用HT-9细胞24 h后，提取细胞蛋白进行免疫印迹分析。结果提示细胞中促凋亡蛋白Bax表达水平随着药物剂量增加而显著升高，与对照组比较差异均有统计意义（P＜0.05）；而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量则随药物剂量升高显著降低，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；上述两种蛋白的

表1 萝卜硫素对HT-9细胞增殖的抑制作用（±s）Tab.1 Inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HT-9 cells（±s）

表1 萝卜硫素对HT-9细胞增殖的抑制作用（±s）Tab.1 Inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HT-9 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 10 μg/mL 萝卜硫素组比较，#P＜0.05；与 20 μg/mL 萝卜硫素组比较，△P＜0.05；与药物作用 24 h 组比较，◇P＜0.05；与药物作用 48 h 组比较，□P＜0.05。

组别对照组 2.1±0.4 3.7±1.1 4.5±1.4 10 μg/mL 萝卜硫素组 16.4±1.4* 23.5±0.7*◇ 29.4±1.6*◇□20 μg/mL 萝卜硫素组 34.4±2.5*# 49.5±3.1*#◇ 66.1±3.8*#◇□40 μg/mL 萝卜硫素组 52.1±3.8*#△ 72.3±4.2*#△◇ 86.9±5.9*#△◇□增殖抑制率（%）24 h 48 h 72 h

图1 萝卜硫素对HT-9细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of sulforaphane on the apoptosis of HT-9 cells

表2 萝卜硫素对HT-9细胞凋亡率的影响（±s）Tab.2 Effect of sulforaphane on the apoptosis rates of HT-9 cells（±s）

表2 萝卜硫素对HT-9细胞凋亡率的影响（±s）Tab.2 Effect of sulforaphane on the apoptosis rates of HT-9 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 10 μg/mL 萝卜硫素组比较，#P＜0.05；与 20 μg/mL 萝卜硫素组比较，△P＜0.05。

组别 凋亡率（%）对照组 2.34±0.62 10 mg/L萝卜硫素组 14.67±1.95*20 mg/L萝卜硫素组 27.95±2.53*#40 mg/L 萝卜硫素组 35.60±3.75*#△

表3 萝卜硫素对HT-9细胞周期的影响（±s）Tab.3 Effect of sulforaphane on the cell cycle of HT-9 cells（±s）

表3 萝卜硫素对HT-9细胞周期的影响（±s）Tab.3 Effect of sulforaphane on the cell cycle of HT-9 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别 G0/G1 G2/M S对照组 41.56±1.29 16.21±1.04 42.23±2.43 10 mg/L 萝卜硫素组 47.04±1.94* 19.34±1.47 33.62±1.48 20 mg/L 萝卜硫素组 56.43±1.52* 21.04±0.94 22.53±1.07 40 mg/L 萝卜硫素组 63.41±2.47* 18.34±1.21 18.25±0.94

表达水平均呈现出药物剂量依赖性。见图2。

2.4 萝卜硫素对PI3K/Akt信号通路的影响 不同剂量的萝卜硫素作用HT-9细胞24 h后，提取细胞蛋白进行PI3K/Akt信号通路活化程度分析。Western Blot结果显示PI3K表达水平及Akt的磷酸化水平均随萝卜硫素浓度升高而显著降低，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示，萝卜硫素可以通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化，从而诱导HT-9细胞的凋亡。见图3。

3 讨论

早期报道萝卜硫素能够通过PI3K/Akt信号通路诱导神经母细胞凋亡和S期阻滞，可能成为一种新的抗肿瘤药物[11]，其中还发现萝卜硫素还可以通过诱导Nrf2蛋白表达，抑制Keap-1蛋白表达。本研究发现萝卜硫素能够阻滞人结肠癌HT-9细胞生长并诱导细胞增殖率降低，其作用效果表现出明显的时间、剂量依赖性。流式细胞术对HT-9细胞凋亡检测发现，萝卜硫素能够显著诱导细胞凋亡的发生，并随着药物浓度升高而显著增强，主要将细胞停留在G0/G1期。

图2 萝卜硫素对Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响Fig.2 Effect of sulforaphane on the expression of Bax,Bcl-2 protein

图3 萝卜硫素对PI3K/Akt信号通路的影响Fig.3 Effect of sulforaphane on the PI3K/Akt signaling pathway

在肿瘤细胞生长、增殖及凋亡的重要病理环节过程中，PI3K/Akt信号通路的异常激活在肿瘤信号传导过程中扮演着重要的角色。研究发现抑制PI3K蛋白的激活能让耐药肿瘤细胞对化疗药物敏感[12-13]，Akt在PI3K信号传导中起着枢纽作用，其中Akt的磷酸化可以活化或者阻滞多条信号传导，如Bcl-2/Bax、mTOR及Caspase-9等。其中Bcl-2/Bax通路蛋白是在细胞凋亡发生过程中起着关键性的作用，也是Akt信号传导的重要下游靶标[14]。Bcl-2家族包括抗凋亡相关蛋白（如Bcl-2）和促凋亡相关蛋白（如Bax）等，在细胞凋亡中起着关键作用，其中Bcl-2/Bax蛋白含量的平衡在细胞是否发生凋亡中起着决定性作用。p-Akt可以分布在线粒体、内质网及细胞核的细胞器内，能够和它的特异性底物发生相互作用，能够调控Bcl-2/Bax蛋白的平衡，以达到控制细胞周期及细胞增殖。目前，PI3K/Akt信号通路在较多的肿瘤细胞中均表现出异常激活，其中PI3K及p-Akt均高度表达。本实验结果也发现萝卜硫素可以明显降低PI3K及p-Akt水平，还抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并诱导了促凋亡蛋白Bax的表达。于是，萝卜硫素可以阻滞Akt的信号传导，使Bcl-2/Bax蛋白表达量出现失衡，活化凋亡信号，诱导结肠癌细胞的凋亡。

综上所述，萝卜硫素能够抑制结肠癌细胞的增殖，诱导其凋亡，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路的活化相关。

（收稿日期：2018-05-15）