万古霉素提取工艺优化及高纯度万古霉素的制备

李志强 朱明新 王玲燕

摘 要：我国万古霉素分离纯化提取工艺于上世纪90年代末开发成功，受到价格优势及管理水平因素影响，全球市场万古霉素原料药95%已被中国占领，但在国际化竞争日趋激烈背景下，万古霉素提取工艺水平有所提升，高品质制药成为市场准入衡量依据。对此，本文分析万古霉素工艺优化方式，提出几点高纯度万古霉素的制备建议。

关键词：万古霉素提取工艺优化；高纯度万古霉素的制备

在新时期，我国万古霉素提取与制备受到广泛重视，主要是我国万古霉素市场价格的优势，管理水平很高，占据了国际市场。但目前国际市场对万古霉素的制备要求有所提升，为更好的进行万古霉素的高纯度制备，应重点关注提取工艺的优化改革，形成独特优势。

1 万古霉素理化性质分析

万古霉素通常稳定性很低，难以精制或结晶，因此制备难度相对较高。在临床使用中，主要为万古霉素盐酸盐，其分子式C66H75Cl2N9O24·HCl，分子量是1486。万古霉素外观颜色为白色，呈现固体状态，水溶性100mg/mL之上，可在甲醇中溶解，但不在高级醇类或乙醚中溶解。如若为低浓度尿素，可在其中添加水提升溶解度。万古霉素分子主要是两个基本结构组合而成，其中糖基结构主要为氨基糖与葡萄糖等。如图1所示万古霉素分子结构形式。

2 万古霉素提取原理分析

万古霉素被发觉之后，早期未得到广泛重视与使用，主要用来进行金黄色葡糖球菌感染处理，然而，耐青霉素细菌产生量增加之后，万古霉素受到广泛关注，在大量生产之后，作用开始逐渐提升。由于初期提取过程中，提取工艺较为滞后，并且万古霉素的稳定性很差，无法开展精制处理或是结晶处理，所以，万古霉素的提取纯度很低。在实际如图2所示，在了解降解途径后，全面分析提取原理：①具有较高的细胞壁形成的抑制作用，可达到杀菌效果；②对新细胞功能造成一定影响，形成细胞膜的破坏性效果；③对蛋白质形成进行干扰，形成微生物的生长抑制作用；④能够抑制核酸的合成，并且降低微生物生长速度，或是从根本上形成抑制的效果。而万古霉素的作用原理为：对细胞壁的合成进行抑制，提升杀菌效果。

3 万古霉素提取工艺优化分析

①发酵液预处理工艺：发酵液预处理属提取工艺最初操作环节，实际处理中，需结合图3的情况进行分析，主要开展发酵液处理工作，以此加快过滤速度，去除杂蛋白成分与固体颗粒成分，为高纯度的制备工作夯实基础，提升生产效果与品质。对于发酵液预处理，在其中添加絮凝剂，调节温度，去除固体物质，提升过滤效果。对pH值的调节，可靠性较高，发酵液稳定性显著，应做好优化处理工作；②发酵液陶瓷膜微滤工艺：发酵液中菌丝浓度通常较高，残留一定比例的培养基，所以，在树脂吸附环节前期，需过滤处理。而陶瓷膜过滤工艺在使用过程中，孔径较佳，有利提高过滤通过量与效果。但实验中发现，过滤通过量与孔径之间并非正向比例，而是曲线关系，主要因为菌体夹杂在过滤物质中，不断积累，形成凝胶层，积累量增加后，导致过滤阻力不断提升，如图4所示，对过滤效果产生影响。所以此类工艺優化的过程中，需要开展膜孔径计算工作，结合实际情况对通过量进行控制，以此提升过滤质量；③解吸液脱色工艺：万古霉素实际发酵期间，夹杂很多碳元素、氮元素、微量元素等物质，在培养期间形成副产物，如：富含蛋白质，导致发酵液的颜色编程褐色。为了制备出白色粉末的万古霉素，消除其中褐色色素，使用解吸脱色工艺开展工作。当前，最常用的是活性炭工艺与大孔吸附树脂工艺。使用此类工艺时，容易受活性炭加量因素、起始pH值因素及脱色时间因素影响，因此需利用实验分析，如表1所示，实验后发现脱色效果与脱色收率之间呈正交关系，所以要对各类因素严格分析与详细调查，使用此工艺前开展多方面调整工作。

在万古霉素解吸液脱色期间，对脱色效率产生影响的因素较多，最为主要的就是活性炭添加数量因素、初始的pH值因素以及搅拌时间等，同时还有温度以及湿度因素，但温度与湿度对其影响的程度较小，可忽略不计。反复试验之后发现，在活性炭添加数量为2.1%且初始pH值为3.1，搅拌时间为61分钟时，脱色效果最好，可达到95.6%左右，有利于提升脱色效率与质量，并促进产业生产效益与经济全面提升，所以，使用此类工艺的过程中，需要对活性炭的添加数量以及其他因素进行严格控制，以此提升脱色效果。

4 高纯度万古霉素制备

传统制备工作受滞后性工艺影响，只能采用溶剂结晶方式处理，纯度较低，例如：甲醇溶剂结晶、乙醇溶剂结晶、异丙醇溶剂结晶、丙酮溶剂结晶或氯化铵与氯化钠溶剂结晶，使万古霉素沉淀，得到成品。但此类制备方式制取纯度较低，成品含很多杂质，导致万古霉素纯度不能满足欧洲药物基本纯度标准。如图5：万古霉素浓缩液分析。现代化药物制备技术发展过程中，色谱分离技术等得到较好进步，可利用色谱分析方式，制备出纯度超95%的成品，再使用乙醇溶剂结晶方式，得到高纯度成品。但此类制备技术尚未将纯度控制在98.1%以上，且色素处理未能体现出独特优势，所以要进一步制备分析与研究。

通过实验方式制备高纯度万古霉素，准备万古霉素粗品与标准品材料，利用改为高纯度万古霉素的制备、盐酸等纯试剂分析，采用高效液相色谱检测试剂分析。准备高效液相色谱仪、电子天平、色谱柱、实验室膜分离仪器、玻璃析柱、冻干燥剂及pH测量仪等。制备万古霉素浓缩液，将250克粗品放置烧杯中，与2升纯化水相溶解，均匀搅拌后，等待完全溶解，使用孔径0.2um左右滤膜过滤处理，得到最终上柱液。使用改为高纯度万古霉素的制备将其制作为直径60厘米、高度8厘米玻璃层柱，实际研究中，还需将上柱量设为整体体积4%左右，使用吸附方式将上柱液与20%层析料有机整合，直接上柱，再使用纯化水清洗，洗涤后采用甲醇预清洗处理。再使用5%甲醇溶液与盐酸溶液开展万古霉素洗脱工作，分段收集处理。此外还需对万古霉素液体浓缩，纯度为96%。色谱分析过程，主要是色谱仪器分析处理，按具体要求与标准完成分析任务，对脱气处理与洗脱处理程序研究，了解其中是否存在缺陷与不足，然后利用制备工艺技术开展相关工作，使各方面制备纯度与效果符合要求，通过正确方式操作提升制备纯度。

我国医疗行业实际发展过程中，药物管制越来越严格，尤其在现代化技术发展背景下，药物种类增加，质量提升，市场准入要求更严格。医院与相关医药客户对万古霉素纯度提出很高的标准，因此，在实际生产的过程中，除了优化工艺方式，还需探索最佳的高纯度制备方法，遵循低成本高质量的生产原则。