陕产瞿麦中总黄酮提取工艺响应曲面法的优化

张爽　刘治飞　高洁　问娟娟

摘要 目的：评价响应曲面法优选出超声辅助提取陕产瞿麦中总黄酮类化合物的最优方案。方法：实验以陕产瞿麦为原料，乙醇为提取剂，在单因素实验的基础上，通过响应面实验对超声辅助法提取陕产瞿麦中总黄酮的工艺进行优化。结果：优选出了超声辅助提取陕产瞿麦中总黄酮的最佳工艺条件：液料比10倍、提取功率140W、乙醇浓度80%时，总黄酮的提取率最大可以达到0.851%。结论：工艺的实验值与预测值基本相符，采用响应曲面法优选超声辅助提取陕产瞿麦中黄酮类化合物的提取工艺稳定可行，为陕产瞿麦资源的开发和利用提供一定的参考依据。

关键词 陕产瞿麦；黄酮类化合物；超声提取；响应曲面法；单因素试验；紫外可见分光光度法；工艺条件；提取率

AbstractObjective：ToselecttheoptimizedplanofultrasonicassistedextractingtotalflavonoidsinHerbaDianthifromShaanxibytheresponsesurfacemethod.Methods：Inthisexperiment，ShaanxiproducingHerbaDianthiwastakenasrawmaterial，andethanolasextractionagent.Onthebasisofsinglefactorexperiment，theextractionprocessoftotalflavonoidsfromHerbaDianthiofShaanxibyultrasonicassistedmethodwasoptimizedwiththeresponsesurfacemethod.Results：TheultrasonicassistedextractionconditionsoftotalflavonoidsinHerbaDianthifromShaanxiwereoptimized：liquidandmaterialratiowas10times，extractionpower140W，80%ethanolconcentration，andtheextractionrateofflavonoidscouldreach0.851%.Conclusion：Theprocessoftheexperimentalvaluesarebasicallyconsistentwiththepredictedvalue，indicatingusingresponsesurfacemethodologytooptimizeultrasonicassistedextractiontechnologyofflavonoidsinHerbaDianthiinShaanxiProvinceisstableandfeasible，andprovidingreferenceforthedevelopmentandutilizationofHerbadianthiresourcesinShaanxiProvince.

KeyWordsHerbaDianthiinShaanxiProvince；Flavonoids；Ultrasonicextraction；Responsesurfacemethod；Singlefactortest；UVvisiblespectrophotometry；Processconditions；Extractionrate

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.056

瞿麦又名野麦、石柱花、十样景花等，为石竹科石竹属植物瞿麦DianthussuperbusL.的干燥地上部分。瞿麦是我国常用的传统中药，性味苦、寒；归心经、小肠经、膀胱经。具有清热利水，破血通经之功效，主治小便不通、热淋、血淋、砂石淋、目赤肿痛、经闭等症[1]。现代药理学的研究表明，瞿麦具有抗肿瘤、利尿、兴奋子宫、抗菌、免疫调节作用、抗氧化作用、溶血作用等作用。其主要成分有皂苷类、环肽类、黄酮类、蒽醌类、有机酸类、挥发油类、生物碱类、维生素、色素及多糖等[2-3]。

响应曲面法是一种统计学试验设计方法，该法通过建立连续变量曲面模型，对影响过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平，而且所需要的观察组数相对较少，可节省人力物力。中药有效成分复杂，有效成分含量相对较低，且在提取过程中会受到很多因素的影响，响应曲面法可以有效的优化中药有效成分的提取工艺，其实验次数少，可以在一定程度上缩短实验周期[4]。本实验以陕产瞿麦作为研究对象，采用响应曲面法对超声波辅助提取陕产瞿麦中的活性成分总黄酮进行了工艺的优化。以期为陕产瞿麦中黄酮类化合物的提取及陕产瞿麦资源的进一步开发和利用提供一定的理论依据。

1材料与仪器

1.1实验材料瞿麦（陕西省眉县药材总公司，经陕西国际商贸学院生药教研室雷国莲教授鉴定为石竹科植物瞿麦DianthussuperbusL.的帶花全草）；芦丁标准品（中国食品药品检定研究院）；无水乙醇（分析纯）；亚硝酸钠（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）。

1.2实验仪器微波萃取仪XH100B（北京详锆发展有限公司）；高速万能粉碎机FW100（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA1104型电子分析天平（天津鑫博得仪器有限公司）；紫外分光光度计UV2400（天津精密科学仪器有限公司）。

2方法

2.1溶液的配制

对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品0.0109g，置于50mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，继续加70%乙醇溶液至刻度，摇匀，制成每1mL含0.218mg的对照品溶液，然后给溶剂贴上标签备用。

供试品溶液的制备取陕产瞿麦粉末5g，精密称取，置于100mL具塞锥形瓶中，加入80%的乙醇50mL，精密称量，超声提取25min，取出放置至室温，加80%的乙醇适量，补足失去的质量，抽滤弃去药渣，取滤液置于25mL的容量瓶中，得到供试品溶液。

2.2测定波长的选择

取试验样品适量，在亚硝酸钠溶液为1.0mL5%存在的碱性条件下，经溶液硝酸铝显色后，以试剂作为空白参比液在420～700nm波长范围内测定吸光度，在506nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。

2.3标准曲线的绘制

精密量取芦丁对照品溶液2、3、4、5、6、7mL，分别置于25mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液lmL，摇匀，放置5min；加人10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加入4%氢氧化钠溶液10mL，用80%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15min，以上述试剂作为空白对照，分别在506nm处测定吸光度[5]。以吸光度（A）为纵坐标，以质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。

2.4陕产瞿麦中黄酮得率的计算

陕产瞿麦中总黄酮得率（%）=提取的总黄酮质量/瞿麦粉末质量×100%。

2.5陕产瞿麦中黄酮的提取工艺的条件

2.5.1单因素实验以乙醇的浓度、液料比、提取功率及超声时间为单因素，考查各因素對陕产瞿麦中总黄酮得率的影响。

2.5.2响应曲面实验设计根据Box-Behnken软件提供的数据模型，以陕产瞿麦总黄酮提取率作为响应面值，并选择乙醇浓度A、液料比B、功率C这3个因素为自变量，采用统计分析软件Design-Expert8.0.6中的响应面进行分析，从而获取最佳工艺参数。见表1。

3结果与分析

3.1芦丁标准曲线

按照2.3的方法绘制芦丁标准曲线，以芦丁对照品的质量（mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到芦丁对照品的标准曲线为Y=0.4637X-0.0426，相关系数R2=0.9966，由此说明芦丁对照品的质量在0.4～1.6mg范围时吸光度与质量呈良好的线性关系。

3.2单因素实验

3.2.1超声时间对总黄酮提取率的影响固定乙醇体积分数80%，提取温度40℃，液料比10（倍），功率160W，准确称取5g瞿麦粉末5份，提取时间分别按10min、15min、20min、25min、30min、35min，进行超声提取，根据陕产瞿麦中总黄酮的得率确定最佳超声功率。见图1。

从图1可以看出，总黄酮得率随着超声时间的增加逐渐上升，到25min时上升较平缓，其原因可能为随着超声时间的增长，是黄酮类化合物溶出不明显，已经达到饱和[6]。因此，虽然提取时间增长了，但总黄酮的得率变化不大。所以，选择25min为最佳提取时间。

3.2.2乙醇浓度对总黄酮提取率的影响固定液料比10（倍），功率160W，提取温度40℃，提取时间25min，准确称取5g瞿麦粉末5份，分别用乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%的乙醇超声提取，根据陕产瞿麦中总黄酮的得率确定最佳乙醇浓度。见图2。

从图2可以看出，总黄酮得率随着乙醇浓度的增加逐渐上升，开始时黄酮得率增加明显，但当乙醇浓度达到80%以后黄酮得率开始下降。其原因可能是随着乙醇浓度的增加，脂溶性的成分被溶解出来，从而干扰了黄酮类化合物的提取，导致总黄酮的得率反而降低[7]。因此，乙醇浓度以80%左右较为合适。

3.2.3料液比对总黄酮提取率的影响固定乙醇体积分数80%，功率160W，提取温度40℃，提取时间25min，准确称取5g瞿麦粉末5份，分别按液料比（倍）为8、9、10、11、12，进行超声提取，根据陕产瞿麦中总黄酮的得率确定最佳液料比。见图3。

由图3可以看出，总黄酮的得率随液料比的增加而逐渐增大，当料液比大于10（倍）时，总黄酮的得率逐渐降低，其原因可能是当液料比增大到一定程度时导致一些非黄酮类物质溶出，与黄酮类物质竞争溶出，干扰了黄酮类物质的溶出[8-9]。因此选取10（倍）为最佳液料比。

3.2.4超声功率对黄酮提取率的影响固定乙醇体积分数80%，提取温度40℃，液料比10（倍），功率160W，提取时间25min，准确称取5g瞿麦粉末5份，分别按80W、100W、120W、140W、160W，进行超声提取，根据陕产瞿麦中总黄酮的得率确定最佳超声功率。见图4。

由图4可知，总黄酮得率随着超声功率的增加逐渐上升，当超声功率为140W时瞿麦总黄酮的得率最高，140W以后总黄酮得率逐渐下降。理论上讲超声功率越大，细胞壁越容易被破坏，越有利于物质的溶出，但在黄酮类物质溶出的同时也导致黄酮类物质结构的破坏或是其他非黄酮类物质的溶出，干扰了总黄酮的得率[10]。因此超声功率选用140W最合适。

3.3响应面试验及结果分析

3.3.1响应曲面法在单因素试验的基础上，运用Design-Expert8.0.6软件，以乙醇浓度A、液料比B、功率C作为超声辅助提取陕产瞿麦中总黄酮提取率的影响因素，再通过以总黄酮的提取率作为响应平表数据进行带入分析，得到表2和表3的回归分析结果。

3.3.2回归模型方程根据表3.6中，陕产瞿麦中总黄酮的提取率作为响应值，再使用Design-Expert8.0.6对数据进行全面的分析，最终得到了多元二次回归模型方程：

其中：Y为陕产瞿麦中总黄酮的提取率，A、B、C为3因素的编码值。

从回归方程方差分析表中可发现，P模型<0.0001，F模型=76.89>0.05，表明了本研究选用的二次回归方程模型非常显著，可以用于实际的预测。陕产瞿麦中总黄酮的提取率F失拟=1.44>0.05，P失拟=0.3564>0.05，表示失拟不显著。表中的决定系数R2=0.9093，调整确定系数R2Adj=0.9771，说明此模型的实验值与拟合值之间有很好的拟合度。

综上所见，该模型可以很好表示出自变量和响应值之间的关系[12-13]。结合表2和表3我们可以分析看出，A、B、AB和BC对陕产瞿麦中总黄酮的提取率都产生显著的影响，其中A和AB对陕产瞿麦中总黄酮的提取率极显著。各因素对于陕产瞿麦总黄酮的提取率影响的排序：乙醇浓度A>料液比B>超声功率C。