当归对血虚便秘模型小鼠结肠水通道蛋白8表达的影响

杜丽东 雒军 吴国泰 牛亭惠 李越峰 袁菊丽 任远

摘要：目的 觀察当归对血虚便秘模型小鼠结肠水通道蛋白8（AQP8）的表达及AC-cAMP-PKA信号通路各因子含量的影响，探讨当归润肠通便作用机制。方法 60只KM小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和当归高、中、低剂量组，每组10只。采用复方地芬诺酯、乙酰苯肼及环磷酰胺联合复制血虚便秘小鼠模型，实验第14日起，当归高、中、低剂量组分别给予16.7、8.8、4.2 g原药材/kg当归水煎液灌胃，阳性药组给予5.0 g/kg常通舒颗粒药液灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，观察小鼠血虚便秘证候、排便时间，免疫组化、Western blot和qRT-PCR检测小鼠结肠AQP8蛋白和mRNA的表达，ELISA检测小鼠结肠AC-cAMP-PKA信号通路中各因子的表达。结果 模型组小鼠出现血虚便秘证候，粪便排出时间较正常组明显延长（P<0.01），结肠AQP8蛋白和mRNA表达及腺苷酸环化酶（AC）、环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）含量显著升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，当归各剂量组小鼠粪便排出时间明显缩短，结肠AQP8蛋白和mRNA表达及AC、cAMP、PKA含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 当归治疗血虚便秘可能与调节结肠AC-cAMP-PKA信号通路，下调结肠AQP8蛋白和mRNA的表达有关。

关键词：当归；血虚便秘；水通道蛋白8；AC-cAMP-PKA；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of Angelica Sinensis Radix on the expression of aquaporin 8 （AQP8） and the levels of AC-cAMP-PKA in colon of blood-deficiency constipation in mice； To identify mechanism of Angelica Sinensis Radix for loosening the bowels to relieve constipation. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into control group， model group， positive medicine group， and Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups， with ten mice in each group. Diphenoxylate， acetylphenlyhydrazine and cyclophosphamide were used to establish blood-deficiency constipation mice models. From the 14th day of the experiment， Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups were given 16.7， 8.8， and 4.2 g/kg Angelica Sinensis Radix Decoction for gavage. Positive medicine group was given 5.0 g/kg Changtongshu Granules Liquid for gavage. Control group and model group were given equal volume of saline for gavage. The symptoms of blood deficiency constipation were observed and defecation time. Immunohistochemistry， Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of AQP8 protein and mRNA in colon， and the expression of AC-cAMP-PKA in colon was detected by ELISA. Results The mice in the model group developed blood deficiency constipation syndrome； the defecation time was significantly prolonged （P<0.01）； the expression level of colonic AQP8 protein and mRNA， AC， cAMP and PKA significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Compared

with model group， the defecation time was significantly shortened in Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups； the expression of AQP8 protein and mRNA and the levels of AC， cAMP and PKA were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The treatment of Angelica Sinensis Radix for blood-deficiency constipation may be related to adjusting the AC-cAMP-PKA signaling pathways and reducing the expression of AQP8 protein and mRNA.

Keywords： Angelica Sinensis Radix； blood-deficiency constipation； aquaporin 8； AC-cAMP-PKA； mice

当归是伞形科植物当归Angelicae sinensis （Oliv.）Diels的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。古医籍记载以当归配伍治疗血虚便秘，如《沈氏尊生书》“润肠丸”，《脾胃论》“导滞通幽汤”；当代名中医亦喜用当归配伍治疗血虚便秘，如李国峰自拟养血润肠方[1]，张东岳的“秘宝康”[2]等。以上方剂均以当归组方治疗血虚便秘疗效较好，但当归润肠通便的药理机制尚不十分明确。有研究表明，结肠黏膜水通道蛋白（AQP）8在粪便的水分吸收、黏液的分泌中发挥重要作用[3]。有研究表明，AQPs C末端磷酸化对其活性有调节作用，文献证实AC-cAMP-PKA途径参与了AQPs的表达调控[4]。本研究采用复方地芬诺酯、乙酰苯肼及环磷酰胺复制血虚便秘小鼠模型，观察当归对血虚便秘模型小鼠结肠AQP8的表达及AC-cAMP-PKA信号通路各因子含量的影响，探讨当归润肠通便作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级KM小鼠60只，6～8周龄，体质量18～22 g，雌雄各半，甘肃中医药大学科研实验动物中心，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验中心，室温22～26 ℃，相对湿度60%，自然昼夜光线，适应性饲养3 d。

1.2 药物及制备

当归，兰州复兴厚药材有限公司，批号160502，经甘肃中医药大学刘峰林副教授鉴定为正品。称取当归饮片，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，过滤，药渣加6倍量水煎煮1 h，合并2次濾液，过滤，浓缩至1.7 g原药材/mL，消毒后分瓶、压盖包装，冰箱保存备用。复方地芬诺酯片，常州康普药业有限公司，批号160502；乙酰苯肼，上海源叶生物科技有限公司，批号20150701258；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号14081021；常通舒颗粒，贵州威门药业股份有限公司，批号160101。

1.3 主要试剂与仪器

GAPDH抗体，美国ImmunoWay公司，批号B4501；SP检测试剂盒、DBA显色试剂盒，北京中杉金桥生物科技有限公司，批号16183A09、K162418A；Trizol Reagent，美国Invitrogen公司，批号108303；Nuclease-Free water，上海前尘生物科技有限公司，批号0000124196；Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司，批号04102；GoTaq? qPCR Master Mix，普洛麦格（北京）生物技术有限公司，批号0000161385；R0010 RIPA组织裂解液、PMSF、10×丽春红染色液、BCA蛋白测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、4×蛋白上样缓冲液、甘氨酸、SDS、Tris，北京索莱宝科技有限公司，批号分别为20161111、20161108、20161027、20161104、20161024、20161115、1203P0614、1207G033、2016S075；山羊抗兔二抗，美国ImmunoWay公司，批号B0101。Benchmark? Plus酶标仪，美国Bio-Rad公司；BX51-32H01型显微镜，日本Olympus公司；低温高速离心机，美国Biofage fresc公司；vortexer振荡涡旋混合器，德国IKA公司；1008E型掌上离心机，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；SMA2000Thermo超微量分光光度计，Thermo Fisher Scientific；Bio-rad iCycleriQ荧光定量PCR仪，美国伯乐公司；ELITE300稳压稳流电泳仪，美国Wealtec公司；AzureC300曝光仪，美国Azure Biosystems公司。

1.4 分组及造模

实验小鼠按性别、体质量随机分为正常组、模型组、阳性药组和当归高、中、低剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组小鼠第1、4、7、10日皮下注射乙酰苯肼60 mg/kg，第10～14日腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，并予复方地芬诺酯混悬液25 mg/kg灌胃（5 d为1个给药周期，期间停药2 d，共4个周期）。

1.5 给药

实验第14日起，阳性药组给予常通舒颗粒溶液5 g/kg（相当于临床60 kg体质量成人日用量的5倍）灌胃，当归高、中、低剂量组给予当归水煎液16.7、8.3、4.2 g/kg（分别相当于临床60 kg体质量成人日用量的20、10、5倍）灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。给药体积10 mL/kg，连续14 d。实验第28日，颈椎脱臼处死小鼠，迅速开腹取出结肠，分离系膜，取近端结肠约1 cm（距盲肠2 cm处），4%多聚甲醛固定，免疫组化检测结肠AQP8蛋白表达；取近端结肠约3 cm（距盲肠3 cm处），沿纵轴剖开，冷生理盐水冲洗后纵向均分，-80 ℃冰箱保存，用于AQP8蛋白和mRNA的检测；取结肠约1 cm（距盲肠6 cm处），用于结肠腺苷酸环化酶（AC）、环磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）检测。

1.6 血虚便秘体征检测

实验期间观察记录各组小鼠活动状态，毛色，口、鼻、唇、尾颜色及排便情况。

1.7 粪便排出时间测定

第27日，小鼠禁食不禁水12 h，每只小鼠给予5%炭末0.5 mL灌胃，单笼饲养并记录小鼠首粒黑便排出时间。

1.8 免疫组化检测结肠水通道蛋白8蛋白表达

采用经典SABC法严格按照说明书进行免疫组化染色。400倍光镜下观察结肠AQP8的表达部位并摄片，用ImageJ图像处理软件，每张切片随机选5个视野，求平均光密度（AOD），计算AQP8的相对表达量。

1.9 RT-PCR检测结肠水通道蛋白8 mRNA表达

采用Trizol法提取结肠总RNA，超微量分光光度计测定260 nm和280 nm吸光度，计算OD260/OD280和OD260/OD230，分析RNA的浓度和纯度。严格按照Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒和GoTaq? qPCR Master Mix（A6001）试剂盒说明书，去除gDNA并合成cDNA，用RT-PCR仪进行扩增。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃复性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次。用2-ΔΔCt法进行分析，以GAPDH为内参，计算AQP8 mRNA的相对表达量。GAPDH引物序列：上游5'-CGTGCCT GGAGAAACCTG-3'，下游5-AGAGTGGGAGTTGA AGTCC-3'，扩增长度242 bp。AQP8引物序列：上游5'-TGGCTGGCCTCTTTGTAGGA-3'，下游5'-GCTGT CATGGTGACTCCTGTT-3'，扩增产物长度200 bp。

1.10 Western blot测定结肠水通道蛋白8蛋白表达

用组织裂解液和PMSF提取结肠总蛋白，BCA法制备蛋白标准曲线，检测各样本蛋白浓度。以总蛋白∶上样缓冲液=3∶1稀释并变性。制备15%聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离并转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，分别与AQP8抗体（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶3000）室温孵育2 h后，4 ℃过夜，次日，HRP标记的二抗（1∶5000）室温孵育2 h，滴加适量ECL发光剂，凝胶成像仪手动曝光15 s，采集图像，用ImageJ软件分析曝光后AQP8和GAPDH条带的灰度值，计算AQP8蛋白相对表达量。

1.11 结肠腺苷酸环化酶、环磷酸腺苷、蛋白激酶A含量测定

按照结肠组织∶PBS=1∶9冰上匀浆，4 ℃、3000 r/min离心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.12 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 当归对模型小鼠体征的影响

正常组小鼠活潑好动，被毛密而有光泽，粪便形状规则，质稍软，互不粘连；模型组小鼠蜷缩，萎靡，被毛枯疏、易掉、光泽黯淡，耳、鼻、唇、尾苍白，排便数量减少，粪便干结、粘连；当归高、中、低剂量组和阳性药组小鼠上述血虚和便秘体征均有所好转，反应较为灵敏，毛色恢复光泽，粪便变软，数量增多。

2.2 当归对模型小鼠首粒黑便排出时间的影响

与正常组比较，模型组小鼠首粒黑便排出时间显著延长，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，当归高、中、低剂量组和阳性药组小鼠首粒黑便排出时间显著缩短，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

2.3 当归对模型小鼠结肠水通道蛋白8蛋白表达的影响

免疫组化染色显示，AQP8主要在小鼠结肠黏膜上皮细胞和杯状细胞表达。与正常组比较，模型组小鼠结肠AQP8表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，当归高、中、低剂量组小鼠结肠AQP8表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图1、表2。

2.4 当归对模型小鼠结肠水通道蛋白8 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠结肠AQP8 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，当归高、中、低剂量组和阳性药组小鼠结肠AQP8 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。

2.5 当归对模型小鼠结肠水通道蛋白8蛋白表达的影响

Western blot检测显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠AQP8蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，当归高、中剂量组小鼠结肠AQP8蛋白表达显著降低（P<0.01）。结果见表4、图2。

2.6 当归对模型小鼠结肠AC-cAMP-PKA通路各因子含量的影响

与正常组比较，模型组小鼠结肠AC、cAMP和PKA含量均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠结肠AC、cAMP和PKA含量均显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表5。

3 讨论

中医认为，血虚是因失血过多、脾胃虚弱、血液生化之源不足或瘀血阻滞导致的血液不足，和/或血的濡养功能减退的一种病理状态。现代医学认为，贫血的成因包括红细胞生成减少（骨髓造血功能障碍、造血物质缺乏或利用障碍），红细胞丢失或破坏过多（失血、溶血）等。有研究发现，血虚证症状在贫血患者中出现率较高，贫血的中医证型以血虚证为主[2]。因此，实验研究常借鉴贫血的研究方法来研究和认识血虚证。目前，便秘动物模型复制和药物干预的主要指标为粪便排出时间。本研究采用乙酰苯肼+环磷酰胺+复方地芬诺酯联合复制血虚便秘模型：利用乙酰苯肼缓慢氧化、破坏红细胞膜；环磷酰胺引起骨髓抑制，使造血细胞生成减少，白细胞和粒细胞数量减少；复方地芬诺酯作用于肠壁阿片受体，降低肠道敏感性，提高平滑肌张力，使肠蠕动减弱，肠内容物滞留时间延长，水分重吸收增多，产生收敛止泻作用。模型组小鼠首粒黑便排出时间显著延长。当归各剂量组均能缩短粪便排出时间。

结肠黏膜表达的AQP8在粪便水分吸收、黏液分泌中发挥重要作用。本研究采用免疫组化、RT-PCR和Western blot 3种方法检测小鼠结肠AQP8蛋白和基因的表达，结果显示当归各剂量组均可明显降低模型小鼠结肠AQP8蛋白和基因的异常升高。与文献报道便秘时结肠AQP8的表达一致[5]。

AC是广泛分布在哺乳动物细胞膜、核膜和内质网膜上的膜整合蛋白，能催化ATP生成cAMP并释放出焦磷酸。cAMP是细胞内参与调节水液代谢和生理活动的第二信使。PKA又称为依赖cAMP的蛋白激酶A，PKA与cAMP结合后，能催化靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，从而调节细胞功能。本实验结果显示，血虚便秘小鼠结肠中AC、cAMP和PKA均显著升高，可能致使结肠AQPs的表达和活性增加，水分吸收增多而形成便秘。当归各剂量组均能显著降低血虚便秘小鼠结肠AC、cAMP和PKA的含量，推测可能由于AC-cAMP-PKA途径中各因子含量下降，AQPs的表达和活性减弱，水分重吸收减少，起到润肠通便作用。

综上所述，当归润肠通便作用机制可能与调节AC-cAMP-PKA信号通路，进而影响结肠AQP8的表达，抑制近端结肠水分吸收、改善结肠润滑功能有关。

参考文献：

[1] 李国峰.养血活血方治疗血虚型便秘的临床研究及对便秘模型小鼠结肠ICC的影响[D].北京：中国中医科学院，2008.

[2] 崔雷.秘宝康对便秘（血虚肠燥）模型小鼠肠道功能的影响[D].郑州：河南中医学院，2013.

[3] 智会，袁维堂.水通道蛋白3、4、8在大鼠慢传输便秘模型结肠粘膜中的表达[D].郑州：郑州大学，2013.

[4] ITOH A， TSUJIKAWA T， FUJIYAMA Y， et al. Enhancement of aquaporin 3 by vasoactive intestinal polypeptide in a human colonic epithelial cell line[J]. Journal of Gastroenterology & Hepatology， 2010，18（2）：203-210.

[5] 钱海华，徐天舒，曾莉，等.通便颗粒调节慢传输型便秘大鼠结肠水通道蛋白3和水通道蛋白8表达的研究[J].中国实验方剂学杂志，2014， 20（24）：180-184.