天津地区规模化生猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定

姜轩，刘梦月，付超，马吉飞，赵瑞利，石青青，胡烨，崔君



天津地区规模化生猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定

姜轩，刘梦月，付超，马吉飞，赵瑞利通信作者，石青青，胡烨，崔君

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

具有特殊血清型的大肠杆菌对人与动物肠道有不同程度的致病性，其中以产肠毒素大肠杆菌（ETEC）危害较为严重。从天津地区规模化养猪场采集 15 例腹泻病猪的直肠拭子样品，接种到 MH、麦康凯、伊红美蓝琼脂培养基进行细菌培养及革兰染色镜检。选取培养基上形态不同的菌落进行生化试验，16S rRNA 序列测定及 BLAST 分析，结果分离到的10株肠杆菌科细菌与大肠杆菌的同源率达 99.6%。合成大肠杆菌肠毒素 ST1、ST2、LT1、IR1 特异性引物，PCR 结果检测到产 LT1 毒素、产 LT1 和 ST1 毒素及产 ST1 肠毒素的3株大肠杆菌。对分离出的产肠毒素 LTI、ST1 的菌株进行药敏试验，结果表明产肠毒素大肠杆菌对新霉素、克林霉素、庆大霉素、青霉素、头孢曲松、丁胺卡那、头孢呋辛、氟苯尼考敏感，为临床产肠毒素大肠杆菌的监测与防控提供依据。

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）；腹泻；分离鉴定；16S rRNA

大肠埃希菌（），革兰阴性短杆菌，在分类上属于肠杆菌科埃希菌属。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为 6 类：肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、产肠毒性大肠杆菌（ETEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）和弥散黏附性大肠杆菌（DAEC）。任继平等[1]报道ETEC感染仔猪后，仔猪出现肠道炎症反应，但 ETEC 对肠道的致病机理尚不清楚[2]。猪的大肠埃希菌感染包括仔猪黄白痢和水肿病、全身系统性感染症、大肠埃希菌性乳房炎及泌尿感染症等[3]。组成大肠杆菌的抗原成分十分复杂，由菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K）组成，这些不同的抗原成分决定大肠杆菌有不同的致病力，H 和 K 抗原有抗机体吞噬和抗补体的能力。

产肠毒素大肠杆菌是导致仔猪断奶前腹泻的主要病原，其致病性取决于他们在宿主小肠上皮细胞的定居能力和产肠毒素的能力[4]。美国农业部最近连续监测报告表明致病性ETEC腹泻仍然主要危害着养猪产业[5]。而ETEC的致病性主要来自O抗原和其毒力因子，ETEC最重要的毒力因子是肠毒素（Enterotoxin，Ent）和菌毛抗原（又称黏附素 abhensin）[6]，肠毒素是 ETEC 在生长繁殖过程中释放的外毒素，分为耐热肠毒素（Heat-stable-enterotoxin，ST）和不耐热肠毒素（Heat-Labile enterotoxin，LT）两种。ETEC 的有些菌株只产生一种肠毒素，即LT或ST；有些则两种均可产生。通常认为产生LT毒素的大肠杆菌较为常见，且危害较为严重。

本研究从天津地区规模化养猪场采集腹泻猪直肠拭子15份，进行细菌分离鉴定，从培养特性、生化特性、血清学、毒力因子及耐药性等方面进行检测，分离到产肠毒素LT1、产LT1和ST1 毒素及产ST1肠毒素的3株大肠杆菌，为天津地区规模化猪场大肠杆菌腹泻病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

从天津地区某猪场采集腹泻猪直肠拭子共 15 份，进行细菌分离培养。

1.1.2 主要仪器设备

恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）；超净工作台（型号 SW-CJ-2D 型）；PCR 仪（BIO RAD）；S1000 凝胶成像系统（BIO RAD）；稳压温流电泳仪。

1.1.3 主要试剂

麦康凯琼脂、MH 肉汤、琼脂粉、伊红-美蓝琼脂、血液琼脂培养基、革兰染液、PCR 引物（金唯智生物科技有限公司合成）；DNA-Marker（DL 2000）、5×Loading Buffer、2×Master Mix（均购自上海捷瑞生物工程有限公司）；1×TAE、核酸染色剂、肠杆菌科细菌生化鉴定管（购自杭州滨和微生物试剂有限公司）、Kovacs 氏靛基质试剂盒、甲基红指示剂盒、V-P 试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养

取腹泻猪的肛门拭子，划线接种到 MH 琼脂培养基，37 ℃ 过夜培养 18～24 h；挑取 MH 琼脂培养基上形态不同的单菌落分别接种到麦康凯、伊红-美蓝琼脂培养基和血琼脂培养基上， 37 ℃ 过夜培养，分别观察记录菌落形态。

1.2.2 革兰染色镜检

分别在MH琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红-美蓝琼脂培养基、血琼脂培养基上用接种环挑取单菌落于载玻片上，革兰染色镜检。

1.2.3 生化试验

将分离菌的纯培养物进行枸橼酸盐利用试验、靛基质试验、乳糖发酵试验、MR-VP 试验等；筛选出菌株再做糖类分解试验。使用时玻管上端用砂轮划痕折断，然后用接种针分别取菌液接种并覆盖灭菌封口膜，置小试管架上于 37 ℃ 培养箱内培养，按规定时间观察记录结果。设置空白对照，利于比对试验结果[7]。

1.2.4 16S rRNA 序列分析

通过PCR细菌通用引物扩增（引物序列为5＇- GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，5＇-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3＇），96 ℃ 预变性 3 min；94 ℃变性 1 min，58 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，30 个循环；最后 72 ℃ 延伸 10 min。

PCR产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行16S rRNA序列测定，与NCBI基因库BLAST比对，根据同源率确定ETEC血清型。

1.2.5 ETEC大肠杆菌的毒素基因测定

将PCR鉴定结果为大肠杆菌的菌株，按照参考文献[8]合成4对特异性引物，PCR鉴定产肠毒素大肠杆菌，引物设计见表1。

表1 大肠杆菌肠毒素引物设计

设计20 μL PCR 体系为：Mix 预混液 5 μL，ddH2O 13 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，菌液1 μL；PCR 反应条件为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，循环30 次；72 ℃延伸10 min。以1.2%琼脂糖核酸凝胶电泳分析PCR 产物。

1.2.6 ETEC 药敏试验

将分离出的 ETEC 菌株均匀涂布于琼脂平板表面，将药敏纸片分别贴于培养基表面。37 ℃ 培养 24 h后观察结果。20 种药物判断标准参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）药敏纸片扩散法[9]。根据有无抑菌圈及其直径大小来判断该菌对各种药物的敏感程度，记录结果。

2 试验结果

2.1 细菌的分离培养

取直肠拭子样本分别在 MH 琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红-美蓝琼脂培养基和血液琼脂培养基划线培养，37 ℃ 培养 18～24 h。在 MH 肉汤固体培养基上呈圆形、表面隆起平滑、边缘整齐、黏稠、大小不同的小菌落，颜色呈半透明灰白色。在麦康凯琼脂培养基上呈现表面隆起平滑、边缘整齐、黏稠、大小不同的粉红色菌落。在血液琼脂培养基上呈现表面隆起、光滑、边缘整齐、黏稠的灰白色群落，未见明显的溶血性菌落。在伊红美蓝琼脂培养基上呈表面隆起、光滑、边缘整齐、黏稠的半透明菌落，泛紫黑色或绿色金属光泽，如图1所示。

图1 细菌鉴别培养结果

注：A 为 MH 琼脂培养基；B 为麦康凯琼脂培养基；C 为血琼脂培养基；D 为伊红-美蓝琼脂培养基

2.2 革兰染色结果

从培养基上挑取单个菌落进行革兰染色镜检，为革兰阴性菌，两端钝圆，且单个存在，杆状，大小不一的短杆菌，如图2所示。

图2 细菌革兰染色镜检结果

2.3 生化试验结果

从固体培养基挑取单菌落进行纯培养后进行生化试验，进一步鉴定细菌生化反应，其中 6 个样品检测结果如表2所示。

表2 生化鉴定结果

生化试验结果表明，MR 试验阳性，VP 试验阴性，枸橼酸盐试验阴性，氨基酸对照试验有的呈现阳性，均发酵木糖和山梨醇，有的则不能利用棉子糖和侧金盏花醇。生化试验结果均符合大肠杆菌生化特性。

2.4 16S rRNA 测序结果

将分离出的细菌通过细菌通用引物扩增出大约 1 500 bp 基因片段，将 PCR 检测和血清凝集结果为阳性的菌株进行序列测定（图3）。

图3 大肠杆菌16S rRNA电泳结果

将测序结果与GeneBank 基因序列BLAST分析，结果显示其中3株大肠杆菌序列与O6∶H16（CP024275），O25∶H16（FJ949577），T1（GU265555），O27∶H7、O15∶H11（CP024245）血清型的大肠杆菌同源率达99%以上。

2.5 产毒素大肠杆菌的毒素基因鉴定

被检测菌株样品中有3个样品检测出产肠毒素大肠杆菌，其中由LT1引物扩增出特异性条带，大小约为280 bp；由ST1引物扩增出特异性条带，大小约为183 bp；其中有一株大肠杆菌检测ST1和LT1阳性。其中ETEC阳性率约为20%（图4）。

图4 电泳结果图

注：M为DL 2000 Marker；1为产LT1菌株；2、3为产LT1、ST1菌株；4为产ST1菌株

2.6 药敏试验结果

由表3可以看出，本试验分离出的 ETEC 菌株对新霉素、克林霉素、庆大霉素、青霉素、头孢曲松、丁胺卡那、头孢呋辛、氟苯尼考敏感；对恩诺沙星、左氧沙星低敏，部分对阿莫西林低敏；部分对林可霉素、阿莫西林和诺氟沙星、甲硝唑、杆菌肽耐药。

表3 3株ETEC药敏试验结果 mm

注：抑菌圈直径在 15 mm 以上用“S”表示，高度敏感；抑菌圈直径在 10～15 mm 用“I”表示，中度敏感；抑菌圈直径在10 mm以下用“L”表示，低敏；无抑菌圈用“R”表示，耐药

3 讨论

通过对猪场腹泻拭子样本进性细菌的分离鉴定、染色镜检、测序及 PCR 特异性检测和血清型诊断，从 10 株大肠杆菌中分离得到 3 株产肠毒素大肠杆菌，肠毒素引物PCR 特异性检测有1株为 LT1 型 ETEC；1株为 ST1 型 ETEC，其中1株同时产肠毒素LT1 和 ST1，其他7株为肠道常在大肠杆菌，产肠毒素大肠杆菌分离率约20%。药敏试验结果表明，可用新霉素、克林霉素、青霉素、头孢曲松、丁胺卡那、头孢呋辛、氟苯尼考等进行临床治疗。

本次仅分离出 LT1 型与 ST1 型产肠毒素大肠杆菌，还有很多危害较大的其他毒素型，而此次分离鉴定未分离出其他毒素型。ETEC可导致猪出现腹泻、水肿等大规模传染性疾病，对断奶仔猪的致死率达15%，其致病性与其毒力因子密切相关，LT 与 ST 毒力因子成为判断 ETEC 致病性的指标之一，由于大肠杆菌抗原型很多，血清凝集试验难以准确测出。

猪腹泻仍是危害当今养猪业的严重问题，是由多种病因引起的综合征。自2010年起，在我国全国范围内中、大规模的猪场、小型猪场及散养户均发生不同程度的腹泻[10]，给猪场造成了巨大的经济损失。统计仔猪在规模化猪场中发病率高达35%～40%，因腹泻引起的死亡率就占到 20%[11]，其中以细菌性腹泻最为常见，具有广发性和传染性。细菌性腹泻的病原主要有大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌等[12]。在生产实践中，仔猪腹泻往往是多种因素相互作用的结果，常呈多重感染和混合感染[13]。因此，加强仔猪的饲养管理和及时做好预防和治疗仔猪腹泻是规模化猪场提高经济效益的重要手段[14]。

ETEC是导致猪腹泻的重要病原[15]，ETEC血清型的诊断对针对规模化猪场治疗猪腹泻有重大意义。ETEC可单独或同时合成耐热肠毒素（ST）或不耐热肠毒素（LT）刺激肠上皮细胞分泌出大量的电解质和水，最终导致机体腹泻[16]。这与从天津规模化猪场得到的粪便样本，病猪表现出水样腹泻一致。在天津养猪业中，腹泻是造成损失严重的疾病之一，因此对细菌性腹泻菌株的分离培养及鉴定有利于产肠毒素大肠杆菌的快速鉴定。由于引起猪腹泻的大肠杆菌血清型范围广、血清型之间的免疫力保护性差，使产肠毒素大肠杆菌的防治有一定困难，本试验仅从腹泻粪便样本中分离出1株LT1型大肠杆菌，1株ST1型大肠杆菌，1株LT1型与ST1型产肠毒素大肠杆菌，其他毒素因子未检测到。产肠毒素大肠杆菌的临床检测及诊断应给予高度重视，这对于我国规模化养猪业的发展具有重大意义。

[1] 任继平，张伟，周栋，等. 芽孢杆菌对大肠杆菌感染断奶仔猪生长性能养分消化率及血液白细胞分类的影响[J].中国兽医杂志，2015，51（1）：31-33，37.

[2] 李海花，朱琪，王世琼，等. 产肠毒素大肠杆菌K88诱导仔猪炎症反应的分子机制[J]. 中国畜牧兽医，2017，44（1）：262-267.

[3] 陈茹. 陕西某猪场仔猪腹泻病原菌的分离鉴定[D]. 杨凌：西北农林科技大学，2015.

[4] 周刚，彭杰，汪国莲，等. 仔猪产肠毒素大肠杆菌F4受体研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医，2017（19）：83-85，89.

[5] 陈盼霖，周明旭，朱国强. 产肠毒素大肠杆菌研究进展和面临挑战[J]. 中国预防兽医学报，2015，37（10）：813-816.

[6] 张恒慧，尤建嵩，徐永平，等. 抗仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2015，42（2）：347-351.

[7] 陈慧敏，陈坤，陈松彪. 河南猪源致病性大肠杆菌分离、鉴定及其生物学特性[J]. 中国兽医学报，2017，37（10）：1880-1885，1903.

[8] 成大荣，高小攀，钱金梅，等. 仔猪腹泻源大肠杆菌的PCR快速检测[J]. 中国预防兽医学报，2009，31（7）：536-539.

[9] 展天松，王彦红，许梦怡，等. 肠致病性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，2015（2）：67-69.

[10] 刘芳芳. 新型仔猪腹泻病的流行特点与免疫学研究[D].聊城：聊城大学，2015.

[11] 陈叁拾. 猪腹泻的综合防治技术[J]. 福建畜牧兽医，2011，33（3）：70-71.

[12] 杨莉，杨茂生，史开志，等. 猪细菌性腹泻的病原分离及血清型鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医，2017（8）：100-102.

[13] 杨宾，黄群兰. 仔猪腹泻的病因及综合防治技术[J]. 山东畜牧兽医，2015，3（5）：23-25.

[14] 王汝都，杨旭东. 规模化猪场仔猪腹泻的发病特点与防治[J]. 畜牧与饲料科学，2011，32（5）：104-106.

[15] 唐树霄. 江苏部分地区致初生、断奶仔猪腹泻/水肿病大肠杆菌的O血清型、毒素型和黏附素型的流行病学调查[D]. 扬州：扬州大学，2013.

[16] Sánchez J，Holmgren J. Virulence factors，pathogenesis and vaccine protection in cholera and ETEC diarrhea[J]. Current Opinion in Immunology，2005，17（4）：388-398.

责任编辑：张爱婷

Isolation and identification of enterotoxigenicfrom large scale pig farms in Tianjin area

JIANG Xuan, LIU Meng-yue, FU Chao, MA Ji-fei, ZHAO Rui-liCorresponding Author, SHI Qing-qing, HU Ye, CUI Jun

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

with special serotype has different degrees of pathogenicity to human and animal intestines, among which enterotoxigenic（ETEC）is more serious. Rectal swabs samples of 15 diarrhoea pigs in Tianjin area were collected and inoculated with MH, MacConkey Agar and eosin-methylene blue agar for bacterial culture and Gram staining microscopy.The colonies with different shape on the medium were tested for biochemical tests, 16S rRNA sequencing and BLAST analysis. The homology rate of 10 strains of Enterobacteriaceae andwas 99.6%. The specific primers ofenterotoxin ST1, ST2, LT1 and IR1 were synthesized. PCR results showed that 3 strains ofproducing LT1 toxin, LT1 and ST1 toxin, and ST1 enterotoxin were isolated. The antimicrobial susceptibility test of isolated strains of enterotoxin LTI and ST1 showed that enterotoxigenicwas sensitive to neomycin, clindamycin, gentamicin, penicillin, ceftriaxone, amikacin, cefuroxime and florfenicol, which provided a basis for the monitoring and prevention of ETEC.

enterotoxigenic（ETEC）; diarrhea; isolation and identification; 16S rRNA

1008-5394（2018）03-0052-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.011

S852.611

A

2018-04-27

天津市高校“中青年骨干创新人才培养计划”项目（无编号）；天津市“131”创新型人才资助项目（无编号）；天津市生猪产业技术体系创新团队-猪细菌病岗位项目（ITTPRS2017004）；天津市应用基础与前沿技术研究计划一般项目（14JCYBJ30000）

姜轩（1995-），女，硕士在读，研究方向：分子病原细菌学。E-mail：806440849@qq.com。

赵瑞利（1979-），女，副教授，博士，研究方向：分子病原细菌学。E-mail：zhaoruili1109@126.com。