青海地区产ESBLs大肠埃希菌基因型分析

蒋惠莉

（青海省西宁市第一人民医院 青海 西宁 810000）

大肠埃希菌是医院感染常见的致病菌，产生超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）菌株的出现，造成现存有效抗菌药物失效，限制了治疗方案的选择。ESBLs具有多种耐药基因，绝大多数定位于耐药菌质粒DNA序列中，同一质粒还可同时携带多个耐药基因，引起多重耐药[1]。在世界各国及国内各地区ESBLs基因类型的分布并不完全相同，有相关研究报道，我国产ESBLs大肠埃希菌基因型以CTX-M为主[2]。为了解本地区产ESBLs大肠埃希菌的基因型特征，对产ESBLs菌株感染的预防、控制和治疗提供更多的信息和依据，本研究检测ESBLs的TEM、SHV和CTX-M型在青海地区的流行状况。现将结果报道如下。

1.材料和方法

1.1 菌株

收集178株青海省内省、市、州、县共5家医院微生物实验室临床分离的产ESBLs大肠埃希菌。参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的纸片扩散表型确证方法[3]，筛选出产ESBLs大肠埃希菌菌株173株。质控菌株为ATCC 25922。

1.2 主要仪器及试剂

法国生物梅里埃VITEK2-compact鉴定药敏系统、ABI steponeplus扩增仪、药敏纸片（OXOID）、质粒提取试剂（上海生工）、扩增试剂（上海生工）、引物（上海生工合成）；DNA marker（上海生工）

1.3 方法

1.3.1 细菌鉴定和药敏试验 临床样本用法国生物梅里埃VITEK2-compact鉴定药敏系统进行菌株鉴定及药敏试验。

1.3.2 表型确证 用NCCLS推荐的表型确证方法（双纸片协同法）筛选出ESBLs菌株。

1.3.3 提取质粒 采用质粒提取试剂盒提取细菌质粒，严格按说明书操作。

1.3.4 PCR扩增[1]

引物：

TEM（P1：TATCCGCTCATGAGACAATA P2：AGAAGTGGTCCTGCAACTTT产物长度717bp）

SHV（P1：TCTCCCTGTTAGCCACCCTG P2：CCACTGCAGCAGCTGCCGTT产物长度593bp）

CTX-M-1（P1：ACGCTGTTGTTAGGAAGTG P2：TTGAGGCTGGGTGAAGT产物长度741bp）

CTX-M-2（P1：ACGCTACCCCTGCTATT P2：CAGAAACCGTGGGTTACGA产物长度829bp）

CTX-M-9（P1:AGTGCAACGGATGATGT P2:GGCTGGGTAAAATAGGTC产物长度774bp）

扩增反应参数 预变性 变性 退火 延伸 最后延伸温度 94C° 94C° SHV 50C°，其余均55C°72C° 72C°时间 5min 45s 45S 1min 8min

PCR扩增体系（总体积50μl）：上、下游引物各2μl，DNA 模板 1μl， PCR Master 25μl，H2O 20μl

PCR扩增：在ABI steponeplus扩增仪进行扩增

1.3.5 PCR产物电泳及测序 采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，凝胶成像系统观察结果，扩增产物由上海生工公司测序，测序结果在Gene Bank数据库进行比较分析[1]。

2.结果

见表1、图1

表1 大肠埃希菌检出基因型别（株，%）

图1 大肠埃希菌基因型别分布

3.讨论

随着科技的进步，越来越多的抗生素被发现，在救治感染患者的同时，抗药性问题也随之而来。近年来各类产ESBLs的菌株种类、数量及基因种类不断增加，使抗感染问题更加困难[4-5]。了解本地区ESBLs基因型的特点，对医院感染监测有重要作用，并可以为本地区流行病学提供数据。 据相关资料报道，浙江地区产ESBLs大肠埃希菌的基因型以CTX-M-14型为主[6]。天津市以SHV型、TEM型、CTX-M-1型、CTX-M-9型为主[7]。通过本次研究，青海地区产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌主要流行基因型别以CTX-M型为主，其次为TEM型。CTX-M型亚型中以14型、55型和15型为主，还有少量的27型、24 型、3型、64型及123型存在。TEM型以TEM-1为主。本实验173株菌中携带耐药基因菌占73.99%，其中只携带一种基因型菌株占53.17%，同时携带多种基因型菌株占20.8%，这说明本地区耐药基因携带菌株比例大，同时携带多基因菌株也较多，这对耐药菌治疗及控制其蔓延提出了更高要求。我们必须重视临床合理用药，加强感染控制，防止多重基因型ESBLs菌的播散。