荧光定量PCR法在检测婴幼儿人巨细胞病毒感染中的临床意义

朱旭峰 王俊玲

（山西省汾阳医院 山西 汾阳 032200）

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是引起新生儿先天性感染的主要病原体之一[1]，并可以导致新生儿表现多种临床症状，包括：新生儿黄疸消退延迟、神经运动障碍、听力障碍、肝功能异常，贫血等[2]。多样的临床症状必须结合实验室检测方法进行诊断，并有效地治疗HCMV感染的疾病，这对检测方的时间的长短、结果的准确性提出更高的要求。本研究中采用荧光定量聚合酶链式反应法对患儿的尿液及其母乳中HCMV-DNA进行定量定性检测，进而可以探讨FQ-PCR的检测方法对婴幼儿HCMV感染诊断中的意义。

1.资料与方法

1.1 临床资料

收集2017年7月1日至2018年6月8日在山西省汾阳医院就诊的疑似HCMV感染的患儿尿液和其母乳标本，尿液标本为54例，乳液标本为68例；年龄1d至2岁。根据儿童的年龄特点分为≥1月组，1月～1岁组，＜1岁组。

1.2 标本采集

初诊次日上午用分别收集儿童的尿液及其母亲的乳液送检，不能及时送检的样本暂时放在4℃冰箱保存，采集过程中必须用无菌离心管。

1.3 仪器与试剂

检测使用仪器是美国ABI7500型荧光定量PCR仪，试剂为达安基因股份有限公司的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法，Cat：#DA-d061）。

1.4 检测方法

严格按照荧光定量PCR检测HCMV-DNA按试剂说明书操作。分别取乳液和尿液1ml存于配套的无菌离心管中，在转速为12000r/min的条件下，离心5min后，去上清，向沉淀中加DNA提取液50μL混匀后置于100℃水浴10min，同样转速下离心5min后取5μL做模板进行相应的定量PCR扩增。

分别取5μL处理后的标准品（包括阳性，弱阳性，阴性标准品）和标本DNA模板于PCR管中，放入PCR仪器样品槽中并根据试剂说明书实验条件进行反应：93℃ 2min，93℃ 45s→55℃60s→10个循环，93℃ 30s→55℃ 45s→30个循环，反应结束后分析计算定量结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行分析。采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.001为差异有显著统计学意义。

2.结果

2.1 尿液和母乳标本的检测阳性率比较

根据两种标本的阳性检出率的比较，差异具有显著统计学意义（χ2=36.27，P＜0.0001），见表1。

表1 尿液和母乳标本中HCMV-DNA FQ-PCR检测结果

2.2 配比检测结果对比

结果发现：尿液阳性率分别为17.8%（8/45），而母乳的阳性率为68.9%（31/45）（表2）；两者差异有统计学意义（χ2=4.39，P＜0.05）。

表245例尿液和母乳标本HCMV-DNA FQ-PCR配对检测结果

3.讨论

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）属于疱疹病毒科，是一种DNA病毒，对宿主具有高度的种属选择性，而且仅在人与人之间进行传播。HCMV的感染现象极其普遍，在我国约有95%以上的人群感染人巨细胞病毒，目前，临床实验室中对HCMV感染的检测方法有很多，主要有：病毒培养、抗体检测和抗原检测，但其均具有一定的局限性，病毒培养检测主要是HCMV分离，从唾液或尿液中分离病毒培养，通过普通显微镜观察鉴定是否有HCMV感染。该方法操作复杂，耗时长，而且灵敏度低。抗体检测主要对宿主血清中HCMV-IgG和HCMV-IgM进行检测，由于我国是HCMV感染的高发地区，HCMV-IgG抗体的阳性率高于90%，根据IgG的检测结果无法确定是否为近期感染；IgM是HCMV感染宿主后产生的，但有些免疫功能不完善的婴幼儿在感染HCMV后产生的IgM量很少，很容易出现假阴性，因此，该检测方法不适用于婴幼儿早期诊断。

本结果显示：出生时间为1月～1岁的婴幼儿母乳检出率和尿液检出率相等，而出生一个月之内的婴幼儿母乳HCMV阳性检出率强于尿液的检出率，通过FQ-PCR法检测母乳中HCMV感染程度，对于先天、后天免疫功能低下或用免疫抑制剂的患儿有指示作用。