当归根、茎中总黄酮的提取工艺优化

罗旭东　李成义　李旭　强正泽　冯晓莉　王明伟　李硕　王燕

中图分类号 R284.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）03-0364-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.18

摘 要 目的：优化当归根、茎中总黄酮的提取工艺。方法：以提取溶剂乙醇的体积分数、料液比、提取时间、提取次数等为考察因素，以提取液中总黄酮含量为评价指标，在单因素试验基础上采用Box-Behnken设计-响应面法优化当归根、茎中总黄酮的回流提取工艺。结果：当归根、茎中总黄酮最优提取工艺分别为乙醇体积分数70%、50%，料液比1 ∶ 40、1 ∶ 30，提取时间1.3、1.7 h，均提取2次；验证试验中总黄酮含量分别为7.253 6、25.144 1 mg/g（RSD=1.57%、1.49%，n=3），与模型预测值（6.942 8、25.703 5 mg/g）的相对误差分别为4.28%、2.24%。结论：优化后的当归根、茎中总黄酮的提取工艺方法简单，重现性和可预测性较好。

关键词 当归；根；茎；总黄酮；单因素试验；Box-Behnken设计；响应面法；回流提取；工艺优化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize reflux extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of Angelica sinensis. METHODS： The reflux extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis was optimized by Box-Behnken design-response methodology based on single factor test using volume fraction of extraction solvent ethanol， solide-liquid ration， extraction time， extraction times as investigation factors， the content of total flavonoids in extract as evaluation index. RESULTS： The optimal extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis was that volume fractions of ethanol were 70% and 50%； solid-liquid ratios were 1 ∶ 40 and 1 ∶ 30； extraction time were 1.3 h and 1.7 h； The number of extraction times is two times. In verification test， the contents of total flavonoids were 7.253 6， 25.144 1 mg/g （RSD=1.57%， 1.49%， n=3）； relative errors of those to predicted value （6.942 8， 25.703 5 mg/g） were 4.28%， 2.24%. CONCLUSIONS： Optimized extraction technology for total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis is simple， reproducible and predictable.

KEYWORDS Angelica sinensis； Roots； Stems； Total flavonoids； Single factor test； Box-Behnken design； Response methodology； Reflux extraction； Technology optimization

當归为伞形科植物当归[Angelica sinensis （Oliv.）Diels]的干燥根，味甘、辛，性温，能补血和血、调经止痛、润燥滑肠，临床上主要用于血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、肠燥便秘等证[1]。当归中主要含苯酞、黄酮、多糖、有机酸等多种类型的化学成分[2-4]，其中黄酮类化合物具有抗衰老、抗菌、保肝、降压、抗癌、抗炎镇痛、免疫调节等多种生物活性[5-9]，且其在人体内不能合成，只能外源性获取[6]。因此，对黄酮类化合物活性成分的提取具有重要的研究价值。

当归药食两用历史悠久，历代本草均对其有记载。经笔者调查发现，2014年甘肃岷县当归种植面积达1.01万hm2，总产量2×107 kg左右[10]。但由于在传统用药习惯中，当归仅以根入药，故每年采收后当归大量的地上部分被丢弃，不仅污染了产地环境而且造成了资源的极大浪费。已有研究表明，当归地上部分中含有很多活性成分，如具有抗菌、抗凝血活性的金丝桃苷、绿原酸等成分[11-12]。近年来，对中药资源进行合理利用并扩大其药用部位等研究已被广泛关注，但关于当归地上部分茎总黄酮的提取和含量测定却鲜见报道。

本研究以乙醇为提取溶剂，采用单因素试验与Box-Behnken设计相结合的方法，以提取时间、料液比、乙醇的体积分数、提取次数等为考察因素，以总黄酮含量为评价指标，采用响应面法优化当归根、茎中总黄酮的回流提取工艺，为当归茎的综合开发利用提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

UV-2401-PC型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）； BT25S型电子分析天平（精度：1/100 000）、 BT124S型电子分析天平（精度：1/10 000）均来源于北京赛多利斯仪器有限公司；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；101-1型电热恒温鼓风干燥箱（北京市永兴仪器有限公司）。

1.2 药材、药品与试剂

采集甘肃岷县十里镇2016年10月初当归根、茎（海拔：2 313.1 m，经度：104°0′ 10″ ，纬度：34°26′ 2″ ），经甘肃中医药大学李成义教授鉴定为伞形科植物当归的根、茎；芦丁对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20771，纯度：98%）；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末2.0 g，用80%乙醇为溶剂，称质量；回流提取1 h，取出，冷却至室温，称质量并用80%乙醇补足减失的质量，过滤，滤液用80%乙醇定容于 100 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精确称取干燥至恒质量的芦丁对照品0.005 03 g，用75%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中。精密吸取0.5、1、2、2.5、4 mL，上述溶液置于10 mL具塞试管中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀；静置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，最后加4%氢氧化钠溶液4.0 mL，加水至刻度，摇匀；静置10 min，于510 nm波长下测吸光度。以吸光度为纵坐标（y）、芦丁质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得方程y=6.254 1x-0.011 3（R2=0.999 6），表明芦丁检测质量浓度线性范围为0.036 98～0.148 9 mg/mL。

2.1.3 精密度、稳定性、重复性和准确度试验 精密吸取供试品溶液5 mL，按“2.1.2”项下方法操作后测定吸光度，连续测定6次，结果吸光度的RSD=1.06%（n=6），表明仪器精密度良好。分别取供试品溶液放置0、2、4、6、8、10、24 h后测定，结果总黄酮含量的RSD=2.38%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1.2”项下方法操作后测定吸光度，结果吸光度的RSD=1.61%（n=6），表明该方法重复性良好。精密称取已知含量的样品粉末0.5 g，共6份，分别精密加入一定量的芦丁对照品溶液（1 mg/mL），按“2.1.1”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1.2”项下方法测定，计算含量及回收率。结果，平均回收率为92.4%（RSD=2.35%，n=6），表明该方法准确度良好。

2.1.4 总黄酮含量的测定 精密吸取各供试品溶液5 mL，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量（mg/g）。

2.2 当归根、茎中总黄酮提取工艺优化单因素试验

笔者在前期试验中发现，回流提取总黄酮含量较超声提取法高，故本试验采用回流提取法提取当归根、茎中总黄酮。以料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取次数为因素，考察各因素提取条件下的总黄酮含量。

2.2.1 乙醇体积分数 精密称取当归根、茎样品粉末2.0 g，固定当归根、茎料液比为1 ∶ 30，于80 ℃恒温水浴中回流提取1 h，考察不同体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇对当归根中总黄酮含量的影响，结果见图1A；同时，考察不同体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇对当归茎中总黄酮含量的影响，结果见图2A。

由图1A、图2A可知，随着乙醇体积分数的增加，当归根、茎中总黄酮含量呈上升趋势，乙醇体积分数分别为80%、50%时总黄酮含量达到最高值，再增加乙醇体积分数而总黄酮含量呈下降趋势，确定当归根、茎中总黄酮提取时乙醇体积分数分别以80%、50%较优。

2.2.2 料液比 精密称取当归根、茎样品粉末2.0 g，固定当归根、茎提取时乙醇体积分数分别为80%、50%，于80 ℃恒温水浴中回流提取1 h，考察不同料液比（根： 1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40；莖：1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、 1 ∶ 30、1 ∶ 35）对当归根、茎中总黄酮含量的影响，结果见图1B、图2B。

由图1B、图2B可知，随着料液比的增加，当归根、茎总黄酮含量呈上升趋势，料液比分别为1 ∶ 35、1 ∶ 30时总黄酮含量达到最高值，再增加总黄酮含量变化微小，综合考虑提取效率，确定当归根、茎料液比分别为1 ∶ 35、 1 ∶ 30。

2.2.3 提取时间 精密称取当归根、茎样品粉末2.0 g，固定当归根提取时乙醇体积分数为80%、料液比1 ∶ 35，当归茎提取时乙醇体积分数为50%、料液比1 ∶ 30；于80 ℃恒温水浴中回流提取，考察不同提取时间（1、1.5、2、2.5、3 h）对当归根、茎总黄酮含量的影响，结果见图1C、图2C。

由图1C可知，随着提取时间的增加，当归根总黄酮含量呈先下降后上升趋势，2.5 h达最大值，且提取时间为1、2.5 h时总黄酮含量差别较小，综合考虑提取效率，确定当归根提取时间为1 h。由图2C可知，随着提取时间的增加，当归茎总黄酮含量呈上升趋势，1、1.5 h呈急剧上升趋势，随提取时间的增加上升趋势变缓，总黄酮含量增长幅度较小，综合考虑提取效率，确定当归茎提取时间为1.5 h。

2.2.4 提取次数 精密称取当归根、茎样品粉末2.0 g，固定当归根提取时乙醇体积分数为80%、料液比1 ∶ 35，于80 ℃恒温水浴中回流提取1 h；固定当归茎提取时乙醇体积分数为50%、料液比1 ∶ 30，于80 ℃恒温水浴中回流提取1.5 h，考察不同提取次数（1、2、3、4次）对当归根、茎总黄酮含量的影响，结果见图1D、图2D。

由图1D可知，随着提取次数的增加，当归根总黄酮含量呈上升趋势，但随提取次数的增加，总黄酮含量变化较小，为提高提取效率，确定当归根提取次数为1次。由图2D可知，随着提取次数的增加，当归茎总黄酮含量呈上升趋势，提取2次时总黄酮含量急剧上升，继续增加提取次数，总黄酮含量变化较小，综合考虑，确定当归茎提取次数为2次。

2.3 当归根、茎中总黄酮提取工艺优化响应面试验

2.3.1 试验设计 在单因素试验的基础上，根据Box- Behnken设计原理，选取提取时间（X1）、料液比（X2）、乙醇体积分数（X3）3个因素为自变量，以所得总黄酮含量为响应值（Y），设计3因素5水平共20个试验点的响应面分析试验，其中14个析因试验、6个中心试验，并综合单因素试验结果确定零水平和波动区。试验设计因素与水平见表1；设计与结果见表2。

2.3.2 模型建立与显著性分析 采用分析软件 Design- Expert 8.0.5对试验数据进行回归分析，得到多元二次回归拟合方程如下：当归根为Y=6.63+0.046X1+0.57X2-0.30X3+0.078X1X2+0.095X1X3+8.5×10-3X2X3-0.083X12-0.31X22-0.93X32；当归茎为Y=25.16+0.16X1+1.22X2-0.51X3+0.1X1X2+0.30X1X3+0.087X2X3-0.22X12-0.82X22-1.03X32。方差分析结果分别见表3、表4。

由表3可知，该模型回归（P=0.001 4<0.01）显著，失拟项（P=0.067 2>0.05）不显著，且该模型相关系数R2=0.881 6，说明该模型与试验拟合良好，表明该模型拟合效果较好，可用此模型来分析和预测回流提取当归根总黄酮的工艺条件。在各因素中，X2、X32极显著，X22显著，其余均不显著；交互项无显著影响。由F值大小可以判断，在所选试验范围内，3 个因素的总黄酮含量影响排序为 X2>X3>X1。由表4结果可知，该模型回归（P=0.000 8<0.01）显著，失拟项（P=0.579 6>0.05）不显著，且该模型R2=0.893 5，表明该模型拟合效果较好，可用此模型来分析和预测回流提取当归茎总黄酮的工艺条件。在各因素中，X2、X22、X32高度显著，X3显著，其余均不显著；交互项无显著影响。由F值大小可以判断，在所选试验范围内，3个因素的总黄酮含量影响排序为X2>X3>X1。

2.3.3 响应面法优化试验 根据拟合模型绘制当归根、茎中总黄酮的响应面图，判断最优参数及各参数之间的交互作用，以此确定最优工艺参数范围，详见图3、图4。

（1）X1-X2。由图3A可知，当X3值一定、X2值不变时，Y值随着X1的增加变化较小，曲线较为平坦；X1值不变时，Y值随着X2值的增加而增加，到达一定程度后，随着X2值的增加变化缓慢。当料液比为1 ∶ 30～1 ∶ 40时，总黄酮含量最高且几乎不变。由图4A可知，当X3值一定、X2值不变时，Y值随着X1值的增加变化不大，曲线较为平坦；X1值不变时，Y值随着X2值的增加而增加，到达一定程度后，随着数值的增加变化缓慢。当X2值为1 ∶ 25～ 1 ∶ 35时，Y值最高且几乎不变。

（2）X1-X3。由图3B可知，当X2值一定时、X3值不变时，Y值随着X1值的增加变化较小，曲线较为平坦；当X1值不变时，Y值随着X3值的增加而增加，到达一定程度后，随着X3值的增加反而下降。当X2值在58%～74%时，Y值最高且几乎不变。根据相似相溶原理可知，当归根总黄酮极性与此范围体积分数乙醇溶液的极性相当。由图4B可知，当X2值一定、X3值不变时，Y值随着X1值的增加变化不大，曲线较为平坦；当X1值不变时，Y值随着X3值的增加而增加，到达一定程度后，随着X3值的增加反而下降。当乙醇体积分数在45%～55%时，Y值最高且几乎不变。根据相似相溶原理可知，当归茎总黄酮极性与此范围体积分数乙醇溶液的极性相当。

（3）X2-X3。结果见图3C、图4C。由图3C、图4C可知，当X1值一定时，Y值随X2值及X3值的增大均呈先增大后减小的趋势，并从图形走向趋势看，X2值的影响效应更大。三者的交互作用與回归方差分析结果一致。

从响应面图可以判断出最佳点均落在试验考察区域内，根据所得到的模型，回流提取当归根、茎总黄酮最优提取条件分别为乙醇体积分数67.53%、48.50%，料液比1 ∶ 39.9、1 ∶ 32.69，回流时间1.34、1.67 h。考虑到实际操作的可行性，将当归根、茎总黄酮的提取工艺条件分别修正为乙醇体积分数70%、50%，料液比1 ∶ 40、1 ∶ 30，回流时间1.3、1.7 h。

2.4 验证试验

分别精密称取3份当归根、茎样品各100.0 g，按上述修正的最优提取工艺进行验证试验，操作方法同前。结果，当归根提取液的总黄酮含量为7.253 6 mg/g（RSD=1.57%，n=3），与理论预测值6.942 8 mg/g基本吻合（相对误差为4.28%）。当归茎提取液的总黄酮含量为25.144 1 mg/g（RSD=1.49%，n=3），与理论预测值25.703 5 mg/g基本吻合（相对误差为2.24%）。

3 讨论

在试验前期，笔者曾采用80%乙醇提取当归茎中总黄酮，结果提取液呈绿色，采用对提取液离心、活性炭吸附、石油醚萃取及石油醚索氏回流提取等方法去除叶绿素，效果均不理想。但在后续单因素试验中发现，乙醇体积分数在50%时当归茎总黄酮含量较高，且提取液为棕黄色，全波长扫描发现无叶绿素吸收峰，推测在此乙醇体积分数条件下叶绿素对总黄酮提取液影响较小。故确定提取当归总黄酮时乙醇体积分数最低为50%，且由此简化了试验步骤。单因素试验结果表明，当归根总黄酮乙醇体积分数为70%，而当归茎乙醇体积分数为50%，由此可推断当归根中黄酮极性较小，而当归茎中黄酮极性较大。

目前，对当归地上部分茎总黄酮提取工艺的研究文献报道较少。Ben-Behnken设计-响应面法相对于正交试验设计和均匀设计法具有预测性好、精确度高的特点，故本课题组采用单因素试验与Ben-Behnken设计-响应面法相结合对当归根、茎总黄酮提取工艺进行优化。验证试验结果发现实测值与预测值的相对误差较小，表明采用响应面法所得优化条件稳定、可靠。另外，经比较发现，当归茎中总黄酮含量约为根中总黄酮的3.24倍。故笔者认为应将当归地上部分特别是茎部合理开发利用，在避免资源浪费的同时可增加经济效益，由此还可提高当地药农生产积极性。本研究结果为当归地上部分茎的开发利用提供了参考依据。

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（收稿日期：2017-06-01 修回日期：2017-07-10）

（编辑：刘 萍）