不同吸附材料及改性处理对三种常见霉菌毒素脱毒效果研究

张立阳，刘 帅，赵雪娇，李文茜，姜 鑫，赵洪波，张永根*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学实验实习与示范中心，哈尔滨 150030）

霉菌毒素（Mycotoxins）是霉菌受胁迫产生的次级代谢产物，粮食作物及饲料等农产品均可能被其污染。自20世纪60年代发现黄曲霉毒素（AFs）以来，已发现300余种真菌代谢产物对人类和动物有毒性作用。

据联合国粮农组织（FAO）调查，世界范围内超过25%粮食作物受霉菌毒素污染[1]。百奥明公司在2004～2013年检测19 757份多国农产品样品发现，霉菌毒素在北美和包括中国在内的亚洲东部呈重度污染态势，威胁畜牧业生产；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素B1（AFB1）是常见和毒性极强霉菌毒素[2]。此外，同一真菌产生多种有毒代谢产物，同种有毒代谢产物也可由多种真菌产生[3]。百奥明调查指出，72%样本至少检出1种霉菌毒素，超过38%样本检出1种以上霉菌毒素[2]。各种霉菌毒素在动物机体内代谢、毒性作用不同，多种霉菌毒素联合污染及毒素间联合作用研究备受关注[3]，食品、饲料等行业中霉菌毒素脱毒尤为重要。

日粮中添加非营养型霉菌毒素螯合剂是目前降低霉菌毒素危害最适用方法，有效的螯合剂可防止或限制霉菌毒素在动物胃肠道中吸收。不同材料（包括硅酸盐、黏土、沸石、蒙脱石、活性炭、聚合体、叶绿素产品、酵母细胞壁等）对AFB1吸附效果不同，取决于吸附材料微观结构如孔径、比表面积、电荷总量和电荷分布等因素[4]。Malachová等制备载铜、载锌、载银离子改性蒙脱石，验证改性后产品阳离子交换能力增强，表现较强抗菌特性[5]。Yu等发现载铜改性处理显著提高蒙脱石吸附能力[6]。此外，季铵盐是工业生产中常见阳离子表面活性剂[7]。谭绍早等将锌离子和季铵阳离子依次与蒙脱土作离子交换反应，制备新型改性蒙脱土复合抗菌剂，表现较强抗菌能力[8]。Feng等利用季铵盐改性纳米蒙脱石，提高其对ZEN吸附能力[9]。因此，本试验通过对高岭石、膨润土、沸石、硅藻土、蒙脱石等无机吸附材料阳离子交换法作载铜（Cu2+）、载锌（Zn2+）、载铜加锌（Cu2++Zn2+）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十八烷基三甲基氯化铵（STAC）、十八烷基二甲基苄基氯化铵（SKC）6种改性处理，研究改性前后材料对AFB1、ZEN和DON 3种毒素吸附能力。旨在比较不同材料对3种常见霉菌毒素脱毒效果，筛选最佳改性方法，为饲料中合理使用霉菌毒素吸附剂提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 吸附材料

无机吸附材料主要包括：高岭石、膨润土、沸石、硅藻土、蒙脱石。所有样品粉碎过200目筛（0.075 mm）。

1.1.2 改性材料

改性材材料主要包括：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十八烷基三甲基氯化铵（STAC）、十八烷基二甲基苄基氯化铵（SKC）、硫酸铜（CuSO4）、硝酸锌（Zn(NO3)2·6H2O）。

1.1.3 霉菌毒素

AFB1、ZEN和DON标准品以及纯品购自Sigma公司，其中标准品用于标准曲线绘制，毒素纯品用于吸附试验。

1.2 无机吸附材料改性

1.2.1 季铵盐改性

准确称取20 g吸附材料溶解至300 mL水中，浸泡，搅拌分散，置于80℃水浴10 min，吸附材料充分溶胀后，加入8 g改性剂（40%吸附材料），80℃，200 r·min-1，4 h，离心，蒸馏水清洗至无Br-和Cl-离子检出，65℃烘干，备用。

1.2.2 载铜载锌及载铜加锌改性

准确称取20 g吸附材料溶解至300 mL 0.1 mol·L-1CuSO4（载铜）或 6 mmol·L-1Zn(NO3)2·6H2O（载锌）溶液中得到悬浮液，pH调整为5.0，在65℃下恒温搅拌4～6 h，4 000 g离心15 min得到沉淀，去离子水反复冲洗，过滤。载铜加锌样品通过完成载铜后重复载锌步骤获得。所有样品于65℃烘干，备用。

1.3 吸附试验

取AFB1、ZEN和DON工作液，加入含25 mg（0.5%添加量W/V，g·mL-1）吸附剂离心管中，以pH 6.0的PBS缓冲液定容至5 mL，3种毒素浓度为2.0μg·mL-1。每个处理设3个重复，以未添加吸附剂为对照。25℃恒温振荡水浴锅中200 r·min-1下振荡吸附60 min。吸附结束后10 000 g离心10 min。取1 mL上清液，加入5 mL三氯甲烷中萃取，氮气吹干后，重新用1.0 mL相应流动相溶解残渣，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，高效液相色谱（HPLC）上机检测3种毒素浓度。

1.4 p H对吸附材料改性前后脱毒能力的影响

25℃室温条件下研究脱毒能力最强吸附剂，在最佳改性方式改性前后pH分别为3.0、6.0和8.0条件下，研究AFB1、ZEN和DON脱毒效果。其中，吸附剂用量为25 mg，霉菌毒素起始浓度为2μg·mL-1，霉菌毒素吸附溶液体积为5 mL，振荡速度为200 r·min-1，吸附时间为60 min。

1.5 吸附时间对吸附材料改性前后脱毒能力的影响

25℃室温条件下研究脱毒能力最强吸附剂，在最佳改性方式改性前后15、30、45和60 min 4个不同吸附时间条件下，研究AFB1、ZEN和DON脱毒效果。其中，吸附剂用量为25 mg，霉菌毒素起始浓度为2μg·mL-1，霉菌毒素吸附溶液体积为5 mL，振荡速度为200 r·min-1。

1.6 吸附材料改性前后对3种霉菌毒素的解吸特性

吸附反应结束后，倾去离心管上清液，残渣物中加入pH 8.0 PBS缓冲液（相当于动物肠道碱性环境）10 mL，于37℃恒温振荡水浴锅中，按200 r·min-1振荡解吸60 min，每隔20 min振摇混匀1次。于4 000 g下离心10 min，测定上清液中毒素含量，计算解吸量。连续解吸4次，计算4次累积解吸率。

1.7 高效液相色谱（HPLC）测定3种毒素浓度

HPLC系统包括：Waters 600泵、Waters 2487紫外检测器、Waters 2475荧光检测器配柱后光化学衍生系统。色谱柱：C18柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，填料直径5μm（Zorbax SB,Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA）。

色谱参数：①AFB1：进样量20μL；流速1.0 mL·min-1；流动相：35 mL色谱纯甲醇，10 mL色谱乙腈，纯净水55 mL混匀后加入0.1%磷酸；荧光检测器激发波长360 nm，发射波长440 nm。② ZEN：进样量20μL；流速1.0 mL·min-1；流动相：46 mL色谱纯乙腈，46 mL纯净水，8 mL色谱纯甲醇，混匀后加入0.1%磷酸；荧光检测器激发波长274 nm，发射波长440 nm。DON：进样量20μL；流速1.0 mL·min-1；流动相：量取100 mL色谱纯乙腈，纯净水定容至1 L；紫外检测器检测波长218 nm。

1.8 最佳吸附材料改性前后结构表征

利用扫描电镜（SEM，日立场发射扫描电镜SU8010）分析吸附材料改性前后表面微观结构变化；利用X-射线衍射（XRD，BRUKER D8 ADVANCE）技术分析吸附材料改性前后层间距等结构特性；利用傅里叶红外光谱仪（FTIR，BRUKER ALPHA-T）技术表征吸附材料改性前后基团分子结构。

1.9 统计分析

试验数据采用SAS 9.2统计软件中ANOVA过程作单因素方差分析，采用Tukey法作平均值多重比较，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同吸附材料改性前后对3种霉菌毒素吸附能力

2.1.1 不同吸附材料改性前后对AFB1吸附能力

吸附材料改性前后对AFB1吸附能力影响见表1。5种原料中，蒙脱石、高岭石和膨润土对AFB1吸附能力较强，约50%～70%，沸石和硅藻土吸附能力较低。除沸石外，所有材料经不同改性处理后对AFB1吸附能力均显著增强（P＜0.05）。其中蒙脱石以季铵盐STAC改性处理后对AFB1吸附能力最强，高达99.48%，与CTAB和SKC改性处理差异不显著（P＞0.05），但极显著高于改性前和载金属离子改性（P＜0.05），高岭石和膨润土两种材料与蒙脱石效果相同。此外，对于吸附能力较强蒙脱石、高岭石和膨润土3种材料，载铜、载锌、载铜加锌3种改性处理中差异不显著（P＞0.05）。沸石和硅藻土2种材料经载金属离子改性后，对AFB1吸附能力仍处于较低水平。

表1 无机吸附材料改性前后对AFB1吸附能力Table 1 Effect of adsorbents and modification treatments on adsorption of AFB 1(%)

2.1.2 不同吸附材料改性前后对ZEN的吸附能力

由表2可知，5种吸附材料原料吸附能力均较弱，最高为蒙脱石，为25%。除沸石外，5种材料经不同改性处理后对ZEN吸附能力均显著提高（P＜0.05）。但载金属离子改性处理后吸附能力与季铵盐改性处理相比提升幅度较小。在所有吸附材料及改性处理中，蒙脱石经STAC处理后对ZEN吸附能力最强，达90%以上，其次为高岭石和膨润土。本试验中沸石样品经改性处理后对ZEN吸附能力均无显著变化（P＞0.05），处于较低水平。

表2 无机吸附材料改性前后对ZEN吸附能力Table 2 Effect of adsorbents and modification treatments on adsorption of ZEN (%)

2.1.3 不同吸附材料改性前后对DON的吸附能力

不同吸附材料及改性处理对DON吸附能力见表3。结果与ZEN吸附能力测定结果相近。其中5种吸附材料原料吸附能力较弱，最高为蒙脱石，仅为17%。经载金属离子改性处理后，蒙脱石和膨润土对DON吸附能力显著增强，但3种改性处理间差异不显著（P＞0.05）。经3种季铵盐改性处理后，吸附能力同样显著提高（P＜0.05），且增加幅度高于载金属离子改性处理。蒙脱石经STAC处理后对DON吸附能力最强，达67%。沸石及硅藻土改性前后对DON吸附能力差异不显著（P＞0.05），处于较低水平。

表3 无机吸附材料改性前后对DON吸附能力Table 3 Effect of adsorbentsand modification treatments on adsorption of DON (%)

2.2 p H对蒙脱石原料及STAC改性后脱毒能力的影响

5种吸附材料中脱毒能力最强的蒙脱石原料及STAC改性后在3.0、6.0和8.0 pH情况下吸附能力见表4。其中，同一材料对3种霉菌毒素吸附能力在不同pH情况下差异不显著（P＞0.05）。pH相同情况下，STAC改性蒙脱石对3种霉菌毒素吸附能力均极显著高于蒙脱石原料（P＜0.01）。

2.3 吸附时间对蒙脱石原料及STAC改性后脱毒能力的影响

不同反应时间下蒙脱石原料及STAC改性后对霉菌毒素吸附能力影响见表5。在15～60 min时不同吸附时间下，蒙脱石或STAC改性后对同一霉菌毒素脱毒能力间差异不显著（P＞0.05）。蒙脱石改性前后相比，对3种霉菌毒吸附能力在不同反应时间下均达显著水平（P＜0.05）。

2.4 蒙脱石原料及STAC改性后对3种霉菌毒素的解吸特性

蒙脱石和改性蒙脱石在pH 6.0偏酸性环境下吸附3种霉菌毒素后，用pH 8.0 PBS缓冲液解吸，模拟吸附材料在动物胃中吸附霉菌毒素后在肠道弱碱性条件下解吸情况，结果见表6。在3种霉菌毒素中，DON解析率最大，其中蒙脱石原料4次累计解析率达到42.19%，其次为ZEN和DON。相比于蒙脱石原料，STAC改性蒙脱石对3种霉菌毒素的解吸率均极显著降低（P＜0.01）。

表4 p H对蒙脱石原料及STAC改性后脱毒能力的影响Table 4 Effect of pH on adsorption capacity of montmorillonitebefore and after modification (%)

表5 吸附时间对蒙脱石原料及STAC改性后脱毒能力的影响Table5 Effect of timeon adsorption capacity of montmorillonitebeforeand after modification (%)

表6 蒙脱石原料及STAC改性后对3种霉菌毒素解吸特性Table6 Desorption of montmorillonitebefore and after modification to three mycotoxins (%)

2.5 蒙脱石原料及STAC改性后结构表征

2.5.1 扫描电镜观察蒙脱石改性前后表面形貌

以扫描电镜分析蒙脱石原料及STAC改性后材料（见图1）。

蒙脱石原料呈块状结构，叠置片层较多，无序堆积，无明显折叠现象且较厚，边缘不规则。经STAC改性后蒙脱石颗粒松散，由于插层反应后层间距扩大，块状转变为光滑多层结构。改性蒙脱石出现较多剥离、疏松、较平坦片层，片层大而薄，边缘尖锐，可见错落孔洞。

图1 蒙脱石改性前后扫描电镜（SEM）结构表征Fig.1 Scanning electron microscopy(SEM)characterization of montmorillonite before and after modification

2.5.2 X-射线衍射（XRD）分析蒙脱石改性前后结构特征

由图2可知，蒙脱石原料及改性处理后X射线衍射角2θ分别为6.02°和3.62°，根据Brag公式（λ=2dsinθ）计算层间距分别为1.45和2.44 nm。表明季铵盐阳离子已成功嵌入蒙脱石层间。

观察蒙脱石与改性蒙脱石XRD图谱，除首峰位置不同外，其余未发生变化，表明STAC基团在交换进片层间后，影响蒙脱石层间距，对晶体结构无影响。

图2 蒙脱石改性前后X射线衍射（XRD）图谱Fig.2 X-ray diffraction(XRD)spectra of montmorillonitebeforeand after modification

2.5.3 傅里叶红外光谱（FTIR）分析蒙脱石改性前后结构特征

由图3可知，蒙脱石特征峰为1 458 cm-1处季铵盐C-H弯曲振动，1 024 cm-1处Si-O-Si伸缩振动峰，515 cm-1处Si-O-Al弯曲振动峰，460 cm-1处Si-O-Si弯曲振动峰。

吸收峰在改性前后未发生显著变化，表明STAC改性对蒙脱石晶体结构无显著影响。但改性处理后，在2 829、2 897cm-1处出现两个较强吸收峰，为STAC改性剂中C-H伸缩振动峰。羟基伸缩振动区域为3 300～3 700 cm-1，通过比较STAC改性前后红外图谱，发现3 597cm-1处吸收峰较尖锐且改性前后无显著变化，为蒙脱石层间结构水的羟基伸缩振动峰。层间吸附水的羟基伸缩振动峰和弯曲振动峰分别为出现在3 401和1 630 cm-1。说明STAC改性剂已成功插入蒙脱石片层间，亲水性减弱，脱去大量层间吸附水，但对层间结构水分子无影响。

图3 蒙脱石改性前后傅里叶红外分析（FTIR）图谱Fig.3 Fourier transform infrared(FTIR)spectra of montmorillonite beforeand after modification

3 讨 论

3.1 不同吸附材料改性前后对不同霉菌毒素吸附能力变化

在吸附剂与霉菌毒素结合过程中，霉菌毒素物理和化学性质是关键因素[10]。试验首先模拟动物胃液偏酸性环境，测定吸附材料原料及改性处理后对AFB1、ZEN和DON脱毒能力。结果显示，高岭石、膨润土和蒙脱石原料相比于沸石和硅藻土吸附性能更强。在3种毒素中，AFB1最易被吸附，其次为ZEN和DON，主要是3种毒素分子极性不同所致。其中AFB1水溶性较ZEN强，AFB1相对分子质量为312，是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，含1个双呋喃环和1个氧杂萘邻酮，极性较强[11]。ZEN相对分子质量为318，为含2酚羟基的内酯，溶于水，仅碱性环境下酯键打开，是弱极性或双极性分子[12]。DON相对分子质量为296.32，属单端孢霉烯族化合物，分子极性较低。AFB1除末端双呋喃环外，其余部分呈平面结构，更易进入平面层间域。呈空间立体结构的ZEN和DON分子因空间位阻效应难以进入蒙脱石层间域。因而极性霉菌毒素AFB1更易被吸附剂有效吸附，弱极性霉菌毒素ZEN和DON难以被吸附[13]。

载铜、载锌是最常用载金属离子改性方法。改性处理后，吸附材料离子交换能力增强[6]，产生较强抑菌杀菌作用[14]。季铵盐改性是对无机吸附材料有机改性的主要方法。本试验显示高岭石、膨润土和蒙脱石等材料经两种改性处理后，对3种霉菌毒素吸附能力显著增强，以季铵盐改性处理后脱毒能力变化幅度更大。其中STAC对蒙脱石改性处理后对3种霉菌毒素吸附能力最强。长碳链烷基季铵盐（如本试验选用的CTAB、STAC和SKC）为常用改性剂，经处理后有机铵阳离子进入粘土晶层空间，片层表面改性，晶层间距增加，片层表面被有机离子上烷基长碳链覆盖，增加粘土与高分子亲和性，同时较长的烷基分子链在片层间以一定方式排列，使层间距增加，有利于聚合物大分子插至片层。

3.2 p H对蒙脱石原料及STAC改性后脱毒能力影响

本试验选用pH为6.0和8.0，接近正常生理条件下动物胃液和肠液pH，利于改性蒙脱石在生产中应用。结果显示，STAC改性蒙脱石在不同pH条件下对AFB1、ZEN和DON吸附性能均极显著高于蒙脱石原料（P＜0.01），表明使用长链STAC对蒙脱石有机改性，可提高蒙脱石对霉菌毒素吸附性能，且不受pH变化影响，与王政等研究结果一致[15]。蒙脱石板面为永久负电荷表面，为可变电荷表面，其电荷零点pH约2.5，当pH＜2.5时，边面带正电荷，且表面净电荷为正，PH＞2.5时，表面以负电荷为主，而蒙脱石对霉菌毒素吸附作用主要取决于其携带电荷量。

3.3 吸附时间对蒙脱石原料及STAC改性后脱毒能力影响

在15～60 min不同吸附时间下，原料或改性后对3种霉菌毒素吸附能力差异均不显著（P＞0.05），即使在最短15 min反应时间下，亦达最大吸附水平。结果表明，吸附材料与霉菌毒素间物理结合迅速。吸附剂竞争性可减少动物胃肠道对霉菌毒素吸收，减轻毒素及代谢对畜禽机体损伤和生产性能影响。

3.4 蒙脱石原料及STAC改性后对3种霉菌毒素解吸特性

吸附材料与霉菌毒素吸附作用可逆，处于动态平衡状态。当吸附剂霉菌毒素结合物由胃中转移进入肠道后，环境变化可能引起二者结合状态改变。蒙脱石原料及STAC改性后对3种霉菌毒素解吸特性结果显示，AFB1解吸率较低，其次为ZEN和DON。表明改性蒙脱石对AFB1有更大吸附稳定性。相比于蒙脱石原料，STAC改性蒙脱石后解析率显著降低，说明改性处理有利二者结合，与齐德生等研究结果一致[16]。解析率降低更有利于二者结合物顺利通过胃肠道排出体外，增强脱毒效果。

3.5 蒙脱石原料及STAC改性后结构表征

由蒙脱石改性前后对3种霉菌毒素吸附能力测定结果可知，STAC处理是最佳改性方式。改性处理后蒙脱石分子由块状结构变为层状结构，且层间距大幅增加。BET分析结果表明，STAC改性处理使蒙脱石层状结构出现更多孔洞，增加比表面积，比较改性前后吸附等温线滞后环发现，下端闭合点未发生变化。改性后蒙脱石滞后环在相对压力p/p°低于0.4前几乎闭合，说明样品微孔孔隙较少，主要是介孔结构。上述结构变化有利于吸附材料暴露更多结合位点，增多进入吸附材料层间霉菌毒素数量，提高二者结合效率[17]。FTIR分析、有机元素分析结果表明，STAC分子中烷基长碳链成功插入蒙脱石层间，排列方式受离子间强烈范德华力影响，具有平卧单层、倾斜双层、假三层和超结构等模式，层间距扩大后可容纳更多霉菌毒素。吸附剂层间疏水环境因表面覆盖烷基长链而改善，由疏油性变为亲油性，对有机物吸附能力增强。此外，除蒙脱石和改性剂结构可以影响吸附剂改性效果外，插层反应时时间、温度、浓度均对蒙脱石改性有重要影响，STAC改性蒙脱石作用最佳条件需进一步研究。

4 结论

蒙脱石为5种材料中最佳脱毒材料，对AFB1、ZEN和DON脱毒能力最强。季铵盐改性效果优于载金属离子，其中十八烷基三甲基氯化铵处理为最佳改性方式。改性后蒙脱石分子结构疏松，STAC基团成功插层至蒙脱石分子结构中，增强其对霉菌毒素吸附能力。