微重力及模拟微重力对微生物遗传变异、致病性与抗性的影响

黄 兵，赵 忺，金显知，刘长庭

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2北京四中科技实验班，北京 100034

失重或模拟失重环境可以诱使微生物在形态结构、生理生化、基因及蛋白等方面发生不同程度的改变，但微重力和模拟微重力对微生物产生效应的分子机制以及其对人体的影响尚不十分清楚。因而，研究失重或模拟失重对微生物的生物学效应及其作用机制不仅为阐明微生物在空间环境中的生理生化改变及其适应机制、微生物与人类之间的相互作用等一系列科学问题提供理论依据，还对未来空间受控生态生保系统的建立、空间微生物安全监控以及空间微生物资源的开发利用等具有普遍的指导意义。以下分别就微重力与模拟微重力对微生物基因与蛋白表达、细胞毒性与抗性的影响展开论述。

1 微生物的空间微重力效应及地面模拟微重力效应研究概述

在空间站和航天员乘员舱中有多种微生物被检出，空间微重力环境可诱导微生物生理生化和遗传性状等发生变异，一些原本对人体和环境无害的微生物种群也会在毒力、致病性、抗生素敏感性等方面发生改变[1-2]。研究表明，空间微重力及地基模拟微重力影响微生物细胞的基因表达[3-9]、蛋白表达[10-12]、细胞毒性[13-15]、细胞抗性[16-18]、生物膜形成[19-21]等。而这些研究涉及的微生物包括细菌、放线菌、真菌和古菌等4大类。主要有在大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母/毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、链霉菌、白色念珠菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌及嗜盐古菌等(表1)。这些菌株大部分为致病性或条件致病性细菌(大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌)和致病性真菌(白色念珠菌)，研究的重点主要集中在细胞毒性、抗性以及耐药性等方面。在非致病的革兰阳性细菌中，枯草芽孢杆菌和链霉菌研究的频率较高，枯草芽孢杆菌主要侧重其生长率，而链霉菌主要侧重其次级代谢。在非致病真菌中，主要研究对象为酿酒酵母和毕赤酵母，酿酒酵母主要侧重其出芽生长过程以及基因表达模式，毕赤酵母主要测重其重组蛋白表达。古菌中主要研究了嗜盐古菌的蛋白表达和细胞抗性方面。

2 微重力及模拟微重力对微生物染色体变异、基因及蛋白表达的影响

2006年Nichols等[22]在基因组学和蛋白组学研究基础上，提出了微重力基因组学和微重力蛋白组学的概念，他认为包括宇航员在内的各种生物在空间飞行过程中出现许多不利的生理变化，可能是机体在空间微重力环境里发生了基因组水平的相关变化引起的，从而引起蛋白质组水平的相应变化。因此，基因组和蛋白组学是研究各种生物的微重力效应的重要手段。

2.1 微重力影响微生物染色体及染色体外DNA的变异和稳定性 Horneck[23-24]对芽孢杆菌孢子和大肠埃希菌及其pUC19质粒航天搭载后的生存能力、芽孢杆菌His位点突变、大肠埃希菌Lac位点突变、DNA链断裂和修复系统的效率等研究后发现孢子突变频率提高，但对质粒DNA无影响。Takahashi等[25]分析了空间微重力环境对大肠埃希菌和酵母菌的作用效果，发现两种菌株的DNA均出现不同程度的突变和SOS效应，暗示微重力在菌株DNA复制或DNA修复过程中诱发了菌株变异及SOS效应。Fukuda等[26]报道，酿酒酵母经40 d空间飞行后，部分样品核糖体蛋白L基因(rpsL)的突变率比地面对照组高2 ～ 3倍。但有学者报道酵母菌经152 h的失重和空间辐射后与地面对照相比，诱导和修复DNA双链断裂的水平并无明显差异，认为失重不能提高酵母菌的突变频率[25,27]。Pross和Kiefer[28]分析微重力环境对辐射的酵母DNA双链断裂修复的影响发现，微生物在空间条件下，兼有稳定性和变异性；微重力环境可能干扰DNA损伤修复系统的正常功能，即阻延或抑制DNA链断裂的修复。美国空间实验室D1飞行中发现，E.coli基因重组率增加的原因是微重力下细菌性纤毛附着时间较地面长，并通过纤毛的结合交换DNA[29]。Beuls等[30]通过3种不同的地基回转器(RWVs、RPM、抗磁悬浮装置)研究了模拟微重力下苏云金芽孢杆菌质粒的接合转移情况，发现模拟微重力对苏云金芽孢杆菌质粒接合转移没有促进也没有抑制，推测苏云金芽孢杆菌这类革兰阳性菌失重条件下的质粒转移现象可能与其抗生素抗性及细胞毒性的扩散特异相关。

2.2 微重力及模拟微重力影响微生物基因组的表达Vukanti等[31]对E.coli K12(ATCC 29425)在模拟微重力条件(STLVs)下的基因表达研究后发现，430个基因差异表达，其中上调的基因主要有对饥饿响应的基因(csiD，cspD，ygaF，gabDTP，ygiG，fliY，cysK)以及饥饿条件的重定向代谢基因(ddpX，acs，actP，gdhA)；多重压力响应的基因，如酸胁迫(asr，yhiW)、渗透压(yehZYW)、氧化性压力(katE，btuDE)；生物膜形成(lldR，lamB，yneA，fadB，ydeY)；curli菌毛生物合成(csgDEF)以及脂类生物合成(yfbEFG)。这些基因的差异表达表明大肠埃希菌在模拟微重力条件下可能受到酸、渗透压以及氧化性压力的胁迫，进而引起基因的差异表达。Vukanti和Leff[32]接着对E.coli K12 MG1655(ATCC 700926)在模拟微重力条件下的基因表达研究后发现，细菌对模拟微重力的响应根据培养基和菌株生长阶段变化而变化，压力响应基因(csiD，cstA，katE，otsA，treA)的过表达只发生在营养丰富的培养基的对数期，而在基本培养基以及丰富培养基的静止期则没有明显差异。Tucker等[33]通过HARVs回转器对菌株E.coli MG1655(CGSC7740)研究后发现基本培养基生长的样品大部分差异表达且功能已知的基因主要与细胞被膜相关；而在营养丰富的培养基中，涉及蛋白翻译的基因对低剪切的模拟微重力较敏感。Arunasri等[34]通过3-D回转器研究E.coli K12 MG1655的模拟微重力效应，发现涉及压力适应性的基因的sufE与ssrA，膜转运蛋白基因ompC、exbB、actP、mgtA、cysW、nikB以及糖分解代谢基因ldcC、ptsA、rhaD、rhaS显著下调。另外参与DNA复制的基因srmB的上调以及核苷酸代谢基因dfp、pyrD、spoT的抑制表达使得模拟微重力条件的菌株生长率提高。

表1 文献中微重力效应研究的主要微生物类别

Wilson等[18]通过基因芯片研究低剪切力的模拟微重力(LSMMG)条件(HARVs)对鼠伤寒沙门菌基因表达的影响，发现其基因上有163个基因差异表达，功能主要涉及转录调控因子、毒性因子、脂多糖生物合成酶、铁离子利用的酶以及其他功能未知的蛋白。而且很多基因位于基因簇中或者在操纵子内部，其中值得注意的是铁离子吸收相关调控基因和铁利用相关的基因(fepD，STM1537，hscB，feoB，yliG，sufC，sufS)参与到低剪切力的模拟微重力的响应过程。Wilson等[9]通过空间飞行试验(Space Shuttle mission STS-115)对鼠伤寒沙门菌研究后发现，转录组学分析显示有167个基因的转录水平发生显著改变，蛋白组学分析显示有73个蛋白表达水平发生显著改变。而这些基因可能是受一个全局性的调控因子—RNA结合蛋白Hfq基因调控的，同时这个基因在地面回转器试验时同样被证实参与了对模拟微重力的响应过程。

Rosado等[15]对Staphylococcus aureus在低剪切力的模拟微重力环境中(HARVs)进行试验后发现其产生的葡萄金黄色素(staphyloxanthin)和主要毒性因子α毒素(α-toxin)的产量减少；另外，通过DNA基因芯片试验发现α毒素生物合成基因hla与saeR/saeS调节基因的表达下降了约2倍。

Crabbé等[35]利用旋转壁式反应器(RWV)和三维回转器(RPM)研究条件致病菌铜绿假单胞菌的模拟微重力效应，发现一个具有调控作用的选择性Sigma因子AlgU参与了响应过程，同时藻朊酸盐(alginate)的产量增加，AlgU控制的调节子表达上调；另外，还发现铜绿假单胞菌中与鼠伤寒沙门菌同源且功能相同的RNA结合蛋白Hfq也参与了模拟微重力的效应过程。Crabbé[4]在接下来的铜绿假单胞菌转录组和蛋白组研究中还发现，在空间飞行试验中，有包括hfq在内的167个基因以及28个蛋白差异表达，其中被诱导的有凝集素基因lecA与lecB，以及参与鼠李糖脂生物合成的鼠李糖基转移酶基因rhlA；另外根据一些参与微量需氧代谢的差异基因可推测铜绿假单胞菌在空间微重力环境中可能采取了厌氧的生长模式[36]。

Allen等[3]利用HARVs回转器研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae TIGR4)在低剪切力的模拟微重力等几种不同条件下的基因表达情况，发现差异表达的基因分别有101个(1×g vs static)、46个(LSMMG vs 1×g)、9个(LSMMG vs static)，另外研究还发现除了低剪切力，回转器的转动也可能参与了肺炎链球菌对低剪切力模拟微重力的响应过程。

Dornmayr-Pfaffenhuemer等[37]通 过RCCSs回 转 器 研究两株嗜盐古菌的模拟微重力效应，两株嗜盐古菌色素沉积及细胞蛋白成分也具有差异，Haloferaxmediterranei对杆菌肽、红霉素、利福霉素的抗性显著增加，而Halococcusdombrowskii细胞聚集现象显著减少。

2.3 模拟微重力影响微生物重组蛋白的表达 Zhang等[38]通过双轴回转器和三重四级杆质谱研究E.coli BL21在模拟微重力条件下表达重组蛋白氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)的特征，发现模拟微重力条件下重组酶蛋白的表达对温度敏感，在18℃培养时，模拟微重力条件下包涵体与可溶部分的SSAO分别增加了83%和116%；然而在37℃培养时，SSAO则分别降低了38%和49%。Qi等[11]通过HARVs回转器模拟微重力研究毕赤酵母β-D-葡萄糖醛酸酶重组蛋白的表达产量，发现β-D-葡萄糖醛酸酶重组蛋白的产率较对照提高了1.51 ～ 2.21倍，同时该酶在细胞外的分泌也提高了。Qi等[10]利用HARVs回转器研究了β-D-葡萄糖醛酸酶重组蛋白在模拟微重力条件下毕赤酵母细胞中的表达，发现该酶的催化效率提高了3.7倍。Qi等[39]利用HARVs回转器研究了重组菌株毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)在模拟微重力条件下的生长、蛋白表达以及转录组变化，发现毕赤酵母的生长加快，重组酶蛋白(β-D-葡萄糖醛酸酶)的分泌和产率提高；通过对四大类别的141个差异基因(涉及甲醇利用、伴侣蛋白、RNA聚合酶、蛋白转运或分泌等)分析显示，甲醇代谢(17个)以及蛋白转运或分泌(37个)的基因表达显著上调，进一步解释了模拟微重力条件下重组酶蛋白增加的分泌和产率。

3 微重力及模拟微重力对微生物致病性与生物膜形成及抗性的影响

空间微重力对病原微生物的致病性与生物膜形成、抗性方面的研究也取得了较大的进展，研究的菌株主要有鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌以及白色念珠菌等。其中对鼠伤寒沙门菌致病性的研究较为深入。

Nickerson[40]研究了地基模拟微重力对鼠伤寒沙门菌致病性的影响，发现菌株毒性增强，即对小鼠的致病性增强，同时对酸环境和巨噬细胞杀伤力的抵抗力增强，他通过试验进一步表明，模拟微重力可能是一种鼠伤寒沙门菌毒性的环境调控因子。2007年Wilson等[9]通过研究发现空间微重力环境实验(Space Shuttle mission STS-115)中鼠伤寒沙门菌的毒性增强，分析显示空间环境对鼠伤寒沙门菌细胞内部调控蛋白Hfq(RNA结合蛋白)的周围流体产生了影响，使其对下游一些毒性相关基因表达产生影响，如生物膜形成与铁离子利用基因等，从而使其对老鼠的致死率较地面对照菌株增强。这一结果与前期通过地基回转器(HARVs)模拟微重力得出的实验结果一致(即毒性增强的结果)，从而进一步证明空间微重力环境对毒性基因的影响和调控。另外，Wilson等[8]研究发现，参与编码鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion systems，T3SSs)的毒力相关基因(orgA，prgH，sipD，invI，invA，pigB，sseB，ssaL，ssaV，sseJ)在模拟微重力环境下表达下调，而TTSSs与许多革兰阴性杆菌毒力因子的分泌相关。Wilson等[41]通过空间飞行试验(Space Shuttle mission STS-123)进一步研究了两种培养基下(LB肉汤培养与M9普通培养基)微重力对鼠伤寒沙门菌毒性的影响，发现其增加的毒性受到培养基无机盐成分及浓度的调控，其中磷酸盐离子可以改变空间微重力条件下菌株毒性的大小，增加磷酸盐离子浓度可以阻止菌株毒性的增强，同时也可以阻止菌株酸抗性的增强。

Chopra等[42]研究发现，模拟微重力条件下肠致病性大肠埃希菌(EPEC)有74种蛋白表达升高，其中18种蛋白表达下调，新表达的蛋白有62种；通过Northern blot方法分析后发现，产毒性大肠埃希菌(ETEC)编码不耐热肠毒素Ⅰ(heat-labile enterotoxin，LT-1)的基因表达上调，LT-1可致感染的小鼠肠腔消化液的过度分泌；此外，该研究还发现经模拟微重力作用后的肠致病性大肠埃希菌使感染的小鼠巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌增加。

Tucker等[33]通过HARVs回转器对菌株E.coli MG1655(CGSC7740)研究后发现基本培养基生长的样品，大部分差异表达且功能已知的基因主要与细胞被膜相关。Crabbé等[35]利用旋转壁式反应器(RWV)和三维回转器(RPM)研究条件致病菌铜绿假单胞菌的模拟微重力效应，结果表明，在模拟微重力条件下，铜绿假单胞菌藻酸盐、弹性蛋白酶、鼠李糖脂产生增加，绿脓菌素的产量无明显差异。此外铜绿假单胞菌在空间飞行及模拟微重力环境下可形成稳固的生物膜，结晶紫染色方法及共焦显微镜观察显示形成的生物膜在剧烈振动条件下仍能稳固存在。进一步研究发现在微重力环境下生物膜的形成受剪切力的影响。在低剪切力条件下，铜绿假单胞菌PAO1菌株形成黏稠的细胞聚集物，而在高剪切力作用下可形成稳固的生物膜。通过基因芯片实验进一步表明模拟微重力条件下，铜绿假单胞菌PAO1菌株有134种基因表达水平高于对照组2倍以上。这些表达增加的基因涉及到各个水平，包括参与各种应激反应的蛋白的合成、致病因子的表达(如基因algP、algR等参与藻酸盐的合成，基因fleN调节鞭毛的合成)，参与各种生理代谢的物质合成以及各种调控因子的合成(如基因hfq参与RNA结合蛋白Hfq合成，algU参与RNA聚合酶σ因子AlgU的合成)等。此外，该研究还发现调节蛋白algU调控铜绿假单胞菌的多种致病因子的产生。在模拟微重力条件下algU可上调藻酸盐合成基因algR和algP，促进藻酸盐合成；可以通过对铜绿假单胞菌群体感应信号系统的调节，上调高丝氨酸内酯(C4-HSL)合成，后者可促进鼠李糖脂的合成；AlgU还可上调伴侣蛋白Hfq的合成，后者在弹性蛋白酶的合成及菌毛的合成中起到重要的促进作用。Crabbé等[19]利用回转器RWVs研究了低剪切力的模拟微重力条件对铜绿假单胞菌的行为，发现回转器中菌株聚集生长的生物膜类似于肺囊性纤维化病人的肺部黏液情况；同时调节群感信号系统的高丝氨酸内酯(C4-HSL)的rhl基因与多糖合成位点基因(psI)显著上调，受到C4-HSL群感信号系统调控的鼠李糖脂受到诱导并且产量提高，而鼠李糖脂在铜绿假单胞菌导致肺囊性纤维化发病过程中发挥重要的作用。Kim等[43]通过2次空间飞行试验(Space Shuttle Atlantis missions STS-132和STS-135)发现空间飞行环境增加了铜绿假单胞菌活细胞的数量、生物膜的生物量和厚度。同时观察到地面没有的生物膜性状，即呈柱状与天蓬状(column和canopy)结构，并且这种现象以及生物膜生物量的增加与培养基中碳源和磷酸盐浓度无关，另外铜绿假单胞菌鞭毛导致的运动行为参与了空间飞行过程新出现这种形态的生物膜形成过程。Aviles等[44]使用大鼠尾吊模型模拟失重生物学效应，对大鼠口腔灌注铜绿假单胞菌，发现模拟微重力条件下大鼠对该致病菌的敏感性增加；使用克雷伯杆菌，采用同样的模拟微重力实验方法也得到了相似的结果。

Rosado等[15]对金黄色葡萄球菌在低剪切力的模拟微重力环境中(HARVs)进行试验后发现金黄色葡萄球菌生长速率和形态无显著差异，葡萄金黄色素(staphyloxanthin)和主要毒性因子溶血素α毒素(α-toxin)的产量减少，另外通过DNA基因芯片试验发现α毒素生物合成基因hla与saeR/saeS调节基因的表达下降了约2倍。

Lawal等[13]利用HARVs回转器研究模拟微重力对鼠疫耶尔森菌的毒性，发现其在低剪切力的模拟微重力条件下毒力相关蛋白YopM产量和分泌、Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion systems，T3SSs)的正常功能受到影响；另外，低剪切力的模拟微重力减弱鼠疫耶尔森菌的毒性，这与其他革兰阴性致病菌报道诱导提高毒性情况相反。

Crabbé等[35]研究空间飞行条件下致病性真菌白色念珠菌的毒性变化情况，通过小鼠注射感染模型发现与地面对照相比毒性没有明显变化。而王佳平等[45]利用回转器研究模拟微重力对白色念珠菌致病性的影响，发现回转模拟微重力导致白色念珠菌生长显著加快，对小鼠的致死速度加快，诱导巨噬细胞凋亡的作用显著增强；同时模拟微重力导致菌株细胞cAMP的水平显著升高；外源性cAMP显著促进菌丝生成，增加其对小鼠的致死率；模拟微重力导致Gβ基因表达显著增加，而其与cAMP产生的相关基因没有明显变化。可见回转器模拟微重力显著增加白色念珠菌致病性，这可能是通过激活Gβ-Gα-AC-cAMP信号转导途径实现的。

Mauclaire和Egli[46]将国际空间站中分离的藤黄微球菌菌株(LT100和LT110)以及地面参照株分为模拟微重力处理组和1G对照组，结果表明经模拟微重力处理组中生长的藤黄微球菌菌株生物量均较对照组增多；同时形成的胞外聚合物(EPS)较对照组减少，而EPS可影响生物膜的厚度和稳定性。Wilson等[8]研究发现在低剪切力的模拟微重力条件下鼠伤寒沙门菌增强的压力抗性与RpoS(初级代谢的Sigma因子，毒力必需的环境压力信号调控蛋白)不相关。Lynch等[17]通过HARVs回转器大肠埃希菌在模拟微重力条件下的多重压力抗性，研究表明大肠埃希菌增加的多重压力抗性可能依赖于σs(rpoS基因的产物)，模拟微重力诱导增加的压力抗性仅在生长稳定期取决于σs，而在对数期则不依赖σs。模拟微重力条件下，对数期内的σs含量比对照低30%，但比稳定期高2倍；进一步分析表明模拟微重力可能影响σs的mRNA及其蛋白折叠的空间结构。大肠埃希菌可形成更厚更稳定的生物膜；该研究还发现模拟微重力条件下大肠埃希菌对氯霉素、青霉素、盐(氯化钠)以及乙醇的抗性均有所增加，敲除rpoS基因(参与调控生物膜的形成)的大肠埃希菌突变株，在模拟微重力条件下形成生物膜密度有所下降，且对乙醇、盐的抗性也相应下降，但对抗生素的抗性却没有变化。

谢琼等[47]通过飞船搭载试验研究发现微生物经搭载后的耐药性遗传指标基本稳定，如产超广谱酶的大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，对头孢他啶等35种抗生素的耐药性没有变化；其他微生物样品如巨兽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌等搭载后对个别药物的耐药性有所减弱，但对多数药物的耐药性不变。空间飞行实验表明，空间微重力环境下需要更高浓度的抗生素才能杀死常见的细菌，表现出抗生素的耐药性增加的特点。NASA通过航天员体内微生物种群的研究表明：在前后5次太空飞行中，航天员之间的固有肠道微生物群落发生部分交换，并且部分固有微生物的抗生素耐药性增加[48]。另外也有报道航天员间肠道固有微生物的交换也增加了感染性疾病暴发的概率[49]。微生物抗性增强无疑增加了未来航天员的健康风险。

4 结语

微重力作为空间环境中最为重要和特殊的因素之一，是地球上所不具备的，对于已经适应地球重力环境的微生物来说，改变其所处重力环境将对他们产生何种影响，对此进行充分研究，将促进和扩大人类在空间环境中的探索活动范围，同时也促进人类对空间环境资源的开发与应用[50-51]。