微小RNA-499对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

谢依诺，吴 丹，时向民，郭红阳，林 琨，国建萍，苑洪涛，王玉堂，单兆亮

1解放军总医院 心内科，北京 100853；2昆山宗仁卿纪念医院 心内科，江苏昆山 215300

充血性心力衰竭(心衰)是一种复杂、多因素的疾病，是多种心脏疾病发展的最终阶段，是心血管疾病中导致死亡率、住院率高的首要原因[1-2]。如今心室快速起搏制作心衰动物模型在心衰机制研究中的应用已被认可[3]，多选用犬、猪等大型动物[4]。随着基因技术的发展，心肌细胞凋亡靶点的发现和基因转染成功率的提高，基因治疗难治性心衰成为一个重要的途径。在基础研究中，由于病毒载体的高昂价格，体内基因转染往往只用于大鼠、小鼠等小型动物。以SD大鼠作为快速起搏心室致心力衰竭模型为充血性心力衰竭的基因治疗研究提供了一种更为适合的动物模型[5]。衰竭的心脏组织中存在心肌细胞的凋亡，而凋亡又可使工作心肌细胞数量绝对减少进而导致心肌收缩力下降。细胞凋亡的过程伴随甚至早于心衰出现，并在心衰进程中起着关键作用[6]。有研究证实在体外心肌细胞分化实验中，miR-499具有促进向心肌细胞分化增殖的作用，在细胞分化晚期可检测到miR-499的高表达[7]。目前有研究表明，PDCD4和PACS2的表达增加可通过线粒体途径促进细胞出现凋亡[8-9]，且miR-499在缺血性心衰过程中可以通过调节两者的表达水平来抑制心肌细胞的凋亡[10]，但非缺血性心衰中参与凋亡的病理生理机制及miR-499对凋亡的保护机制尚不明了。我们通过转染腺相关病毒使快速起搏致心衰大鼠的miR-499表达上调，并检测miR-499、PDCD4、PACS2的表达水平的改变，进而探讨miR-499的过表达对心肌细胞凋亡的影响。

材料和方法

1 材料 雄性SD大鼠24只，体质量(300±10) g，由解放军总医院实验动物中心提供；3%戊巴比妥钠(解放军总医院动物实验室提供)；埋藏式动物起搏器(上海复旦大学电子工程系提供)；电极导线(自制)；呼吸机(型号：HX-200成都泰盟科技有限公司)；多道生理信号采集处理系统(RM6240CD型，成都仪器厂)；Siemens Sequoia 512超声诊断仪(探头型号：15L8)；小型动物手术台；手术器械。

2 构建rno-miR-499腺病毒相关载体及空载体及其AAV-9型病毒包装 根据大鼠miR-499基因序列设计miRNA，Invitrogen公司合成miRNA片段，下划线部分为BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点。rnomiR-499-F：GATCCGCTGTTAAGACTTGCAGTGAT GTTTAGCTCCTCTCCATGTGAACATCACAGCAAGTC TGTGCTGCG；rno-miR-499-R：AATTCGCAGCAC AGACTTGCTGTGATGTTCACATGGAGAGGAGCTAA ACATCACTGCAAGTCTTAACAGCG；分别用100µl退火Buffer充分溶解合成DNA片段。分别对应各取2µl DNA引物片段，加入至16µl退火Buffer中，充分混匀，100℃退火自然冷却至室温。退火产物分别用无菌水稀释100倍。载体pAAV-ZsGreenmiRNA用限制性内切酶BamHⅠ+EcoRⅠ双酶切。琼脂糖凝胶回收酶切大片段。将质粒pAAVZsGreen-miRNA回收大片段与rno-miR-499的稀释退火产物连接，经过一系列处理后，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒。挑取菌落送测序，测序引物为ZsGreen-F。挑选鉴定正确的克隆。用高效转染试剂盒(HETKit)将病毒载体导入293AAV细胞，48 h后从滤过的上清液中收集AAV颗粒，未经限制性内切酶切切割的载体pAAV-ZsGreenmiRNA(pAAV-NC)可作为空载体组的转染。

3 动物分组及处理 大鼠随机分为4组(n=6)：1)假手术组(Sham group)；2)假手术+miR-499组(Sham+miR-499 group)；3)起搏+空载体组(Pacing+NC group)；4)起搏 +MiR-499组 (Pacing+miR-499 group)。各组大鼠均行起搏器及电极置入术(具体步骤参见本人已发表文章[5])，其中上调miR-499组别(2、4组)大鼠在右心室心尖部缝合电极后，于左心腔内注射滴度为1×1012vg/ml病毒200µl，同时夹闭主动脉10 s使病毒在心脏收缩的基础上经冠状动脉均匀转染至心肌组织[11]，余操作同前。所有手术组术后每日腹腔注射青霉素200 000 U 7 d。需要起搏的组别(3、4组)术后5 d开始间断打开起搏器开关，术后7 d开始以550/min频次快速持续起搏4周，假手术组(1、2组)不进行起搏处理。

4 心功能检测 1)心脏超声检查：停止起搏后，3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉，记录心率，用超声心动图测定左心室射血分数、左心室短轴缩短率。2)血流动力学检测采用多道生理信号采集处理系统：麻醉下经右颈外动脉，插管至左心室，测定左心室舒张末压、左心室收缩末压及左心室压力微分。

5 病理检查 完成以上检查后处死动物，迅速取出心脏并称重；沿左心室冠状切面取心肌组织，进行HE染色、TUNEL染色后光镜检查。

6 qRT-PCR检测miR-499的mRNA水平 血流动力学检查结束后，快速取出处死大鼠心脏，0.9%氯化钠注射液清洗后放入-80℃冰箱保存。抽提总RNA：取少量左心室游离壁心肌组织，加入1 ml Trizol溶液使用组织研磨器将心肌组织研碎，收集心肌组织溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，静置5 min；加入200µl氯仿，剧烈振荡混匀30 s，使水相和有机相充分接触，室温静置2 min；4℃下，14 000 r/min离心15 min，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管；加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10 min沉淀RNA；4℃下，14 000 r/min离心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗涤两次，超净台风干；加入15 ～ 60µl DEPC水溶解沉淀。检测总RNA的纯度和完整性。使用颈环法逆转录RNA，合成cDNA。从GeneBank中查找SD大鼠miR-499的序列，用Premier Primer软件设计引物，U6为内参基因。rno-miR-499-5p上游引物：TTAAGACTTGCAGTG ATGTTT；U6-F上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；按照说明书，用ABI Prism 7000(Applied Biosystems)渗入法配制反应液、行PCR循环。取PCR扩增产物5µl，2%琼脂糖凝胶电泳，溴化己啶染色，紫外线激发后凝胶成像仪照相。

7 Western blot检测PDCD4与PACS2的蛋白表达水平 4℃下用含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液裂解心肌组织或心肌细胞1 h。获得的蛋白样品以Bradford比色法测定蛋白质浓度。配制SDSPAGE凝胶，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热5 min。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，恒压电泳90 ～ 120 min。转到硝酸纤维素膜上，膜用丽春红染色。用Western洗涤液漂洗1 ～ 2 min，洗去转膜液。加入Western封闭液，室温封闭60 min。吸尽封闭液，立即加入稀释好的PDCD4一抗，室温孵育1 h。回收一抗，加入Western洗涤液，摇动洗涤5 ～ 10 min，共洗涤3次。吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温孵育1 h。回收二抗，加入Western洗涤液，摇动洗涤5 ～10 min，共洗涤3次。抗原抗体复合物用ECL类试剂检测，蛋白带的密度用光密度法测量，计算与肌动蛋白的光密度的比率，对照组的比率设为1。

8 TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡 取左心室游离壁0.5 cm3组织块用石蜡包埋，54µm连续切片，常规HE染色与TUNEL标记染色。切片常规脱蜡水化，将烧杯盛200 ml的0.01 mol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液，加热至90 ～ 95℃迅速放入切片，加入双蒸水(20 ～ 25℃)80 ml迅速冷却，将玻片用PBS(20 ～ 25℃)洗3次；加20%正常牛血清室温放置30 min；将TUNEL反应混合液加在切片上，37℃温育90 min；用PBS洗3次；用3% H2O2甲醇液室温阻断10 min；37℃温育90 min，加POD转化剂37℃温育30 min；用PBS洗3次每次5 min DAB/H2O2显色；苏木素淡染，常规脱水，透明中性树胶封固。光学显微镜下观察。

9 统计学方法 采用SPSS18.0进行统计学分析，正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心功能检测 心脏超声及血流动力学检测：相较于Sham组，Pacing+NC组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率、左心室压力微分均显著降低；而Pacing+miR-499组上述指标较Pacing+NC组有所回升，差异均有统计学意义(P＜0.05)。相较于Sham组，Pacing+NC组大鼠的心率及左心室舒张末压均有显著升高，而Pacing+miR-499组上述指标较Pacing+NC组有所降低(P＜0.05)。见表1。

2 qRT-PCR检测各组大鼠心肌组织miR-499的mRNA水平 未注射miR-499腺相关病毒的组别(Sham组和Pacing+NC组)相较于注射miR-499腺相关病毒的组别(Sham+miR-499组和Pacing+miR-499组)，后者心肌组织内miR-499的表达显著增加 (图 1)。

图 1 各组大鼠的心肌组织miR-499表达水平的qRT-PCR法检测结果(aP＜0.01)Fig. 1 MiR-499 expression of myocardium in rats by qRT-PCR(aP＜0.01)

表1 心脏超声及血流动力学检测结果Tab. 1 Echocardiographic and hemodynamic results

3 Western blot检测各组大鼠心肌细胞PDCD4与PACS2的蛋白表达水平 Western blot检测结果可见，相较于Sham组，Pacing+NC组大鼠心肌组织PDCD4和PACS2的表达水平明显升高。相较于Pacing+NC组，Pacing+miR-499组大鼠心肌组织PDCD4和PACS2的表达水平降低(图2)。同时，我们根据对Western blot的结果做了半定量灰度分析(图3)。说明miR-499的上调可使快速起搏致心衰大鼠的PDCD4和PACS2表达降低。

图 2 各组大鼠的心肌PDCD4及PACS2蛋白表达水平(蛋白印迹法)Fig. 2 Expression of PDCD4 and PACS2 protein in rat myocardium by western blot

图 3 各组大鼠的心肌PDCD4及PACS2蛋白表达水平的蛋白印迹法检测结果的半定量灰度分析柱状图(aP＜0.01, bP＜0.05)Fig. 3 Semi-quantitative grayscale analysis of expression of PDCD4 and PACS2 protein in rat myocardium by western blot (aP＜0.01, bP＜0.05)

图 4 各组大鼠心肌组织切片HE染色 (×400)Fig. 4 HE staining images of rat myocardial tissue section (×400)

图 5 各组大鼠心肌组织切片TUNEL染色 (×400)Fig. 5 TUNEL staining images of rat myocardial tissue section (×400)

4 MiR-499对心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响 大鼠于处死后迅速取出心脏沿左心室冠状切面取左心室心肌组织，进行HE染色后光镜检查，结果显示假手术组及假手术+miR-499组心肌细胞形态正常，轮廓清晰，纤维排列整齐、横纹清晰，无病理改变。起搏组可见心肌细胞水肿、有些心肌细胞出现脂肪样变性、间质充血、炎细胞浸润、心肌纤维排列紊乱，上调miR-499的起搏组大鼠心肌组织上述情况减轻(图4)。取左心室游离壁0.5 cm3组织块用石蜡包埋，54µm连续切片，TUNEL标记染色(图5)，并制作半定量柱状图(图6)。切片结果肉眼可见Pacing+NC组大鼠心肌组织中出现大量被染至深褐色的TUNEL阳性细胞，而Sham组及Sham+miR-499组大鼠心肌细胞中肉眼几乎不可见上述病理改变，上调miR-499表达的起搏组凋亡小体数量较起搏组明显减少。柱状图结果更明显直观地反映出上述改变，起搏组细胞TUNEL阳性细胞率明显高于Sham组及Sham+miR-499组，说明快速起搏刺激可促使动物模型心肌细胞出现凋亡，同时Pacing+miR-499组的TUNEL阳性细胞率明显低于Pacing+NC组，说明上调miR-499的表达可显著抑制快速起搏刺激后心衰动物模型心肌组织的凋亡(P＜0.05)。

图 6 各组大鼠心肌组织切片TUNEL染色半定量分析心肌细胞凋亡率(aP＜0.01)Fig. 6 Semi-quantitative analysis of cardiomyocyte apoptosis rate in rat cardiac slices by TUNEL staining (aP＜0.01)

讨 论

在本研究中，我们成功建立了心室快速起搏致心衰大鼠模型，同时我们发现：1)心室快速起搏可以使实验动物体内miR-499表达水平显著降低，凋亡增加，并出现心衰。2)上调miR-499的表达，可以减轻心肌细胞凋亡，说明miR-499在快速起搏致心衰大鼠动物模型中具有抑制心肌细胞凋亡的作用，在快速起搏致心衰的大鼠模型中，持续快速的心室起搏可致心室重构及室壁应力的增加。

相关文献显示，PDCD4可通过影响eIF4A和eIF4G的翻译促进肿瘤细胞的凋亡[8,12]。一些体外的研究也表明，在缺乏PDCD4的胰岛素β细胞中，促凋亡基因水平降低而抗凋亡基因的水平增加[13]。PACS2也是细胞凋亡的启动因子，它可以加速线粒体死亡通路激动子的移位[14-15]。同时，我们成功建立了快速起搏致心衰的大鼠模型来探究miR-499在非缺血性心衰的抗凋亡作用，实验过程中我们发现快速起搏致心衰大鼠模型的心肌细胞凋亡率与其他动物模型(如狗，猪)基本一致[9,16]，本实验中我们发现，在感染AAV-miR-499后，起搏致心衰大鼠模型中过表达的miR-499可通过降低PDCD4和PACS2.的表达来降低心肌细胞的凋亡率。

本实验具有局限性，对于下调miR-499的表达是否会使快速起搏致心衰动物模型的心肌细胞凋亡率进一步增加未进行更全面的印证，此外现阶段未对心衰过程中神经体液因子水平的变化进行深入的研究。

本研究结果表明，上调miR-499的表达可显著抑制快速起搏致心衰大鼠心肌细胞的凋亡。同时，我们发现PDCD4和PACS2是与凋亡密切相关的重要因子，并很有可能参与了心衰过程中心肌结构的重塑。这些实验结果都强有力地说明了miR-499可以通过调节PDCD4和PACS2的表达影响心肌细胞的凋亡。