CD44和CD133标记的PEG纳米脂质体miR-425对结直肠癌干细胞的抑制及其机制研究

陈海云 廖洪利 杜希利

（喀什地区第一人民医院检验科 新疆 喀什 844000）

肿瘤干细胞是一群肿瘤中少数具有干细胞性质的细胞，目前在白血病、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中发现了肿瘤干细胞[1]。miRNA分子在肿瘤发生发展过程中具有独特的表达特征和生物学功能，miRNA在肿瘤的分子诊断和治疗中具有广发的应用前景[2]。近年来，研究者构建了多项非病毒纳米载体，高效的将miRNA或者siRNA入胞，抑制靶基因表达，达到治疗肿瘤的目的。已有研究证实[3]miR-425分子在肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌和肾癌等多种肿瘤中发挥着重要功能，在肿瘤的诊断、治疗及预后中具有临床应用价值。

1.资料与方法

1.1 一般资料

人结直肠癌HCT116细胞购自ATCC细胞库；细胞培养基：DMEM培养基+10%胎牛血清；培养箱环境为：CO25%+37℃ 恒温箱中养。DMEM培基、Real-Time PCR、购买自GIBCO公司；引物在上海生工合成，CD133和CD4抗体购自BD公司，PDL1抗体购自abcam公司。脂质体转染试剂购自life公司，miR425慢病毒载体购自上海吉玛生物公司。

设立空白组（PEG纳米脂质体），对照组（转染control）和实验组（转染miR425慢病毒载体）。

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR（Real-Time qRT-PCR）

（1）冰上配制反应液

表1 Real-Time PCR反应体系

配置好后，混合均匀，并瞬时离心以沉降管内所有物质于管底。

（2）使用 CFX96 ™ Real-Time PCR Detection System 扩增仪进行mRNA 的Real-time PCR 实验

表2 Real-Time PCR反应程序

熔解曲线分析从 65℃开始到95℃停止，间隔 0.5℃。

（3）每个基因设置3个复空，实验结果结算△△Ct值，之后进行统计学分析。

1.2.2 检测PDL1表达水平 HCT116细胞转染48h后，收集细胞，裂解，SDS-PAGE电泳分离，转膜至PVDF膜上，4℃一抗孵育过夜，1*TBST洗涤3次/5 min，二抗37℃ 孵育1hours，1*TBST洗涤3次/10 min，电化学（ECL）发光试剂显色，X射线胶片压片后显影、定影。

1.2.3 CCK8实验

（1）将调整细胞密度为1000～10000/well，每孔加入200µL细胞悬液。

（2）放置于5%二氧化碳，37℃ 培养箱中培养。

（3）接种细胞后，到达每个时间点时，每孔加CCK8溶液20µL，孵育 4h。

（4）酶标仪450nm测定每个孔的吸光值。

1.2.4 双荧光素酶活性测定

（1）24孔板中接种适量的细胞，待密度达到60%～80%转染。PGl3-enhancer报告载体和pRL-TK载体质粒按照10：1的比例混匀，转染细胞。

（2）转染48h后，去除细胞培基，预冷的1×PBS，轻洗3次去除培养板内液体。

（3）用双蒸水将5×PLB裂解液配置为1×PLB裂解液，100µL/孔1×PLB裂解液，将培养板-80℃冰箱静置15分钟，室温下静置裂解15分钟，用移液器吹打细胞。

（4）每孔加入10µL裂解物，每组3个复孔，将96孔板放置于酶标检测仪，加入LARII底物30µL，测得Luciferase 荧光素酶活性值。

（5）迅速加入Stop&Glo试剂30µL，测得pRL-TK海肾荧光素酶的荧光强度。

（6）相对荧光素酶活性=Luciferase荧光素酶活性值/pRL-TK海肾荧光素酶活性值的比值。

2.结果

2.1 肿瘤干细胞的干性

HCT116细胞转染48小时后，空白组CD133和CD44双阳性细胞数量为（1.16±1.01）%，对照组细胞CD133和CD44双阳性细胞数量为（0.99±1.12）%，实验组CD133和CD44双阳性细胞数量为（0.36±0.88）%，提示过表达miR425抑制结直肠癌干细胞的自我更新能力。

HCT116细胞转染48小时后，将20个单细胞种植于基质胶表面，直至形成肉眼可见的克隆时，终止实验，结果显示，空白组、对照组和实验组肿瘤球细胞数目为（4±1）、（5±1）和（2±1）。实验组形成的肿瘤球数目最少。

2.2 细胞生长

CCK8实验检测空白组活性为（0.62±0.23），对照组为（0.72±0.13），实验组为（0.32±0.05），实验组生长能力明显受到抑制。

2.3 蛋白质印迹杂交(Western bloting)和Real-Time PCR检测miR425和PDL1表达

HCT116细胞转染48小时后，Real-Time PCR 检测显示，实验组的miR-425的相对表达水平为（201.4±21.3），对照组与空白组分别为（2.1±1.23）和（2.4±0.88），实验组明显高于对照组与空白组（P＜0.05）。Western blot实验结果显示，空白组、对照组和实验组PDL1的相对表达量为（0.97±0.12）、（0.93±0.22）和（0.34±0.13），实验组PDL1表达显著降低。miR-425的表达与PDL1表达成负相关。

3.讨论

在生物体细胞中RNA含量丰富，除了mRNA、tRNA和rRNA外，还存在其他的非编码小RNA，它们在细胞内扮演了非常重要的角色，构成了细胞内高度复杂的RNA调控网络。miRNA在生物体的多种调控过程中扮演着重要作用例如细胞增殖、细胞周期、细胞死亡、细胞衰老、细胞分化和器官发育等过程。有学者认为结直肠癌是由一小群未分化、致瘤性CD133细胞产生和扩增的恶性肿瘤，CD133应该可以成为将来临床治疗结直肠癌的有效靶点[4]。如果肿瘤的生长、转移、和耐药的根源确实是由于少量肿瘤干细胞，纳米这就可以解释目前临床上恶性肿瘤治疗失败的原因。因为目前临床使用的多数治疗方法并不是针对肿瘤干细胞的，所有尽管它们可以使恶性肿瘤体积缩小甚至完全消退，但这些效果通常是短暂的[5]。只要肿瘤干细胞没有被根除，纳米剩下的肿瘤干细胞足以导致肿瘤复发和转移。因此，针对肿瘤干细胞的治疗战略可能是根治肿瘤、阻止肿瘤转移和解决肿瘤耐药的关键。

本文设立了空白组、对照组和实验组3组细胞利用PEG纳米脂质体包裹的miR-425高效的将miRNA运输至细胞内，仅有100nmPEG纳米脂质体极易穿过毛细血管，延长了肿瘤组织与脂质体的接触时间，纳米脂质体在肿瘤组织部位聚集，浓度得到提升，提高了药物或miRNA对肿瘤的靶向作用。研究证实PEG纳米脂质体能够延长脂质体在血液循环中存留时间，并且能够高效的将药物或其他小分子物质带到肿瘤组织部位，提高了药物的时效性。

细胞功能实验检测miR-425过表达后细胞增殖、侵袭和迁移能力变化。结果显示miR-425过表达能够明显抑制结直肠癌干细胞的自我更新能力、结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。双荧光素酶证实miR-425通过抑制PDL1的表达抑制结直肠癌的生长。因此，本研究系统研究了miR-425抑制肿瘤干细胞干性和分子机制。与本文研究结果一致，贾等[6]研究证实miR-425能够通过降低PDL1表达抑制结直肠癌生长和增殖能力。综上所述，探究了miR-425在结直肠癌干细胞中的作用及其发挥生物功能的分子机制，为结直肠癌的治疗提供新的靶标。