丁郁柿蒂汤对肝郁脾虚延迟性CINV大鼠SP和NK-1受体表达的影响*

韩 琦，李洪海 ，李 萍 ，安 冬 ，李 璐， 梁永林

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

延迟性化疗后呕吐( delayed chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV)指在化疗24小时后发生的恶心呕吐，可持续病发数天，是化疗药物带来的主要副作用之一。研究[1]表明，CINV的发生几率为70%～80%，是临床面临的高发难题。临床对延迟性CINV的控制最为不足。西医学研究表明,P物质(substance P，SP)是延迟性CINV的关键性神经递质[2]，与神经激肽-1 受体(natural killer cell-1 receptor，NK-1)受体一同在延迟性CINV中起主导作用。丁香与郁金虽是相畏药物，但二者同用于难治性、顽固性呕吐的治疗，可收到良好疗效[3]。丁郁柿蒂汤即丁香柿蒂汤加郁金和甘草。本实验研究了丁郁柿蒂汤对延迟性CINV作用，并通过检测其对延迟性CINV模型大鼠SP及NK-1受体、PPTA表达的影响，探讨其干预延迟性CINV的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级Wistar雄性大鼠48只，体质量(200±20)g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，SPF级动物质量合格证号：SCXK(甘)2015-0001。饲养于甘肃中医药大学动物实验室，温度为(21±4)℃，湿度为50%±5%，自然光照，自由进食、饮水。

1.2 药品、试剂与仪器

丁香、柿蒂、甘草、生姜、郁金、党参缓释颗粒剂，均购自甘肃中医药大学附属医院。注射用顺铂，齐鲁制药有限公司所产品，批号6M023A89。阿瑞匹坦胶囊，Merck Sharp&Dohme Ltd.产品，批号M046386。ELISA试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司，批号2017-04-04；GoScriptTMReverse Transcription System(批号0000185600)、GoTaq®qPCR Master Mix(批号0000250185)，均为美国Promega公司产品；TRIzol®Reagent，美国Ambion公司产品，批号113405；PPTA、NK-1引物，由上海生工生物工程公司设计、提供。EX423ZH-E型电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司产品；3K15型通用台式高速离心机，德国Sigma公司产品；DM-86L626型立式超低温冰箱，海尔公司产品；BioradiMark酶标仪，美国BIO-RAD公司产品；TU-100C型恒温金属浴，上海一恒科技有限公司产品；反转录仪，美国BIO-RAD公司产品；QuantStudio®5 Real-Time荧光定量PCR仪，美国Thermo Fisher Scientiflic公司产品；TMC1206210型掌上离心机，生工生物工程(上海)股份有限公司产品 。

1.3 模型的建立与分组

本研究采用慢性束缚法 21 d 复制肝郁大鼠模型[4]，采用腹腔注射顺铂注射液复制延迟性 CINV 模型[5]。将48只大鼠于实验前先置于实验室适应性饲养 7 d,然后进行造模。除正常对照组外,其余大鼠均采用慢性束缚法复制肝郁型大鼠模型。肝郁造模完成后，去除体质量不合格的大鼠，采用完全随机分组法将实验大鼠分为模型对照组、阿瑞匹坦组、丁香柿蒂汤组、郁金组、丁郁柿蒂汤组5组，每组6只。给大鼠投以高岭土适应性饲养 3 d 后，腹腔注射顺铂6 μg/g 复制延迟性CINV大鼠模型，于造模前1 h分别灌胃治疗,并于第1次灌胃后每12 h 灌胃1次。丁香柿蒂汤组、郁金组、丁郁柿蒂汤组依次灌胃相应药物，剂量分别为7.3，4.9，12.2 g/(kg·d)；阿瑞匹坦组第1天灌胃剂量为0.011 4 g/(kg·d)，第2，3天给药剂量为0.007 0 g/(kg·d)。

1.4 检测指标

实验过程中观察各组大鼠的一般情况。延迟性CINV造模后每12小时称量1次高岭土的食用量。在延迟性CINV造模72 h后取材。取下腔静脉血、回肠和延髓组织，采用酶联免疫吸附测定法检测P物质含量，采用实时荧光定量PCR法检测组织PPTA 和 NK1 受体 mRNA表达。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠的一般情况对比

正常对照组大鼠皮毛顺泽，体质量逐渐上升，精神、睡眠状态正常，饮食量正常，大便干稀适中、成形，未见粪质变硬或稀便，反应灵敏。其余大鼠在肝郁造模后，前5天行为亢奋，解开束缚后活动活跃，四处跑动，着急寻食，抓取反应激烈；从第6天开始，大鼠蜷卧安静，好扎堆，解开束缚后活动迟缓，寻食减少，对声响等外界刺激反应迟缓，抓取后弓背对峙，食量减少，饮水增多，较正常对照组饮食量变化明显，体质量减轻，大便减少，便干，毛发粗糙、缺乏光泽；从第 14天开始，大鼠出现目色暗红、缺乏光泽，掉毛现象。在延迟性CINV造模 72 h 后，模型对照组大鼠除有以上肝郁的表现外，还出现体质量下降、食量减少、饮水量减少、扎堆蜷卧少动、活动迟缓、大便不成形。大鼠经过 3 d 灌胃给药后，丁香柿蒂汤组饮食量略增多，大便状况改善；郁金组大鼠目色由暗红转为正常红色，仍安静蜷卧，饮食减少，大便稀溏；丁郁柿蒂汤组大鼠目色由暗红转为正常红色，精神状况略好转，食量增加，反应较前灵敏，大便良好、成形而不干。结果表明:肝郁脾虚大鼠模型建立成功。丁郁柿蒂汤对大鼠的治疗效果良好，而郁金组大鼠出现了脾虚泄泻症状。

2.2 各组大鼠高岭土摄食量对比

高岭土适应期第3天(-24-0 h。以延迟性CINV造模开始时间记为0 h，负数表示造模前)，与正常对照组对比，模型对照组和各药物组大鼠高岭土摄食量均增加，差别有统计学意义(P<0.01)。腹腔注射顺铂注射液(即延迟性CINV造模)后0-72 h，与正常对照组对比，模型对照组大鼠高岭土摄食量升高，差别有统计学意义(P<0.01)，说明成功复制延迟性CINV模型。腹腔注射顺铂注射液后0-24 h，与模型对照组对比，丁香柿蒂汤组、丁郁柿蒂汤组高岭土摄食量均降低(P<0.01)，阿瑞匹坦组高岭土摄食量在12-24 h增高，郁金组不具有统计学差别。24-36 h，与模型对照组对比，阿瑞匹坦组大鼠高岭土摄食量降低最为显著(P<0.01)，郁金组大鼠高岭土摄食量明显增高(P<0.05)。36-48 h，郁金组大鼠高岭土摄食量明显降低，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)。48-72 h，与模型对照组对比，各给药组高岭土摄食量均降低，其中丁郁柿蒂汤组高岭土摄食量降低尤为显著(P<0.01)。以上结果表明：郁金组大鼠高岭土食用量先显著增高后迅速降低。阿瑞匹坦在24 h后发挥显著疗效，保持较为平稳状态。丁郁柿蒂汤干预延迟性CINV大鼠具有良好疗效，最终的治疗效果优于阿瑞匹坦。见表1。

组 别-24-0 h0-12 h12-24 h24-36 h正常对照组1.011±0.080##1.171±0.371##0.855±.0058##0.368±0.054##模型对照组1.251±0.070**3.131±0.072**2.596±0.082**2.058±0.366**阿瑞匹坦组1.303±0.071**2.760±0.063**##3.206±0.070**##0.751±0.037**##丁香柿蒂汤组1.246±0.071**2.511±0.108**##1.246±0.062**##1.500±0.357**郁金组1.258±0.049**2.970±0.082**2.413±0.776*2.846±0.190**#丁郁柿蒂汤组1.303±0.071**1.861±0.083*##1.243±0.069**##1.251±0.160**#

组 别36-48 h48-60 h60-72 h0-72 h正常对照组0.345±0.079##0.130±0.050##0.124±0.010##0.500±0.744##模型对照组1.258±0.163**1.151±0.089**1.135±0.066**1.888±0.658**阿瑞匹坦组0.623±0.037**##0.748±0.057**##0.751±0.033**##1.474±0.733**##丁香柿蒂汤组0.748±0.034**##0.745±0.068**##0.498±0.057**##1.206±0.767**##郁金组0.623±0.008**##0.622±0.041**##0.750±0.057**##1.665±0.524**##丁郁柿蒂汤组0.713±0.077**##0.617±0.020**##0.374±0.009**##1.010±0.959**##

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各组大鼠血清、回肠、延髓SP表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清、回肠、延髓中SP表达均升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，阿瑞匹坦组、丁香柿蒂汤组、丁郁柿蒂汤组大鼠血清、回肠、延髓中SP均降低(P<0.05或P<0.01)，其中丁郁柿蒂汤组SP的降低最为显著。郁金组大鼠的SP在血清、回肠中表达量较高，与正常对照组对比差别有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组对比差别无统计学意义(P>0.05)；在延髓中表达量减少，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清、回肠、延髓SP表达对比

组 别血清回肠延髓SP正常对照组0.100±0.007##1.471±0.166##0.787±0.064##模型对照组0.203±0.009**2.496±0.213**1.799±0.217**阿瑞匹坦组0.157±0.004**##1.676±0.113##1.276±0.037**#丁香柿蒂汤组0.172±0.012**#2.018±0.191**##1.344±0.077**#郁金组0.203±0.003**2.248±0.185**1.302±0.025 **#丁郁柿蒂汤组0.152±0.003**##1.630±0.142##1.058±0.055 **##

注：与正常对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01

2.4 各组大鼠回肠、延髓PPTA mRNA表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠回肠、延髓PPTA mRNA表达明显升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，阿瑞匹坦组、丁香柿蒂汤组、丁郁柿蒂汤组大鼠回肠、延髓中PPTA mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)，其中丁郁柿蒂汤组降低最为显著(P<0.01)。郁金组大鼠回肠PPTA mRNA表达与模型对照组相近，差别无统计学意义(P>0.05)；延髓PPTA mRNA表达降低，与阿瑞匹坦组、丁香柿蒂汤组相近，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)。见表3。

组 别回肠延髓正常对照组1.000±0.000##1.000±0.000##模型对照组2.450±0.073**2.164±0.114**阿瑞匹坦组2.078±0.090**#1.525±0.094**##丁香柿蒂汤组0.988±0.172##1.459±0.047**##郁金组2.452±0.110**1.464±0.089**##丁郁柿蒂汤组0.626±0.147*##1.146±0.076##

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01

2.5 各组大鼠回肠、延髓NK-1受体 mRNA表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠回肠、延髓NK-1受体 mRNA表达明显升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，阿瑞匹坦组、丁香柿蒂汤组、丁郁柿蒂汤组NK-1受体 mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)，其中丁郁柿蒂汤组NK-1受体 mRNA表达的降低最为显著(P<0.01)。郁金组大鼠的回肠NK-1受体mRNA表达升高，与正常对照组对比差别有统计学意义(P<0.01)，与模型对照组对比差别无统计学意义(P>0.05)；延髓NK-1受体表达明显降低，与正常对照组对比差别无统计学意义(P>0.05)，与模型对照组对比差别有统计学意义(P<0.01)。见表4。

组 别回肠延髓正常对照组1.000±0.000##1.000±0.000##模型对照组2.280±0.123**2.195±0.063**阿瑞匹坦组1.915±0.099**#1.671±0.148**#丁香柿蒂汤组1.561±0.087**##1.383±0.195##郁金组2.215±0.158**1.159±0.150##丁郁柿蒂汤组1.074±0.150##0.604±0.260##

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与顺铂模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

3 讨 论

本研究综合慢性束缚法与腹腔注射顺铂注射液，成功建立了肝郁脾虚延迟性CINV模型。经过连续束缚 21 d，大鼠出现目色暗红、掉毛、好扎堆、对外界反应迟缓、大便干等肝郁症状。顺铂是一种高致吐化疗药物，能损伤脾胃引起呕吐。近年来的研究认为,化疗药物属外邪，具有寒凉肃杀之性，属于“药毒”或“药邪”范畴[6]。外邪侵袭，损伤正气，导致中阳不足，脾虚而脾胃升降失职。在本研究中，大鼠在注射顺铂注射液后，除出现肝郁症状外，还有体质量下降、食量减少、饮水量减少、大便不成形等脾虚症状。

丁郁柿蒂汤由丁香柿蒂汤加郁金、甘草组合而成。运用丁郁柿蒂汤干预延迟性CINV与延迟性CINV的特殊证型相关。寒凉肃杀之性的化疗药物损伤正气，导致中阳不足，脾虚而脾胃升降失职[6]，发为延迟性CINV。《黄帝内经》云：“邪之所凑，其气必虚。”文献研究发现，呕吐的基本病机为脾气虚[7]，因而延迟性CINV以脾虚为主，脾虚而胃失和降。延迟性CINV的难治性与顽固性的原因不仅在于脾胃还在于肝。作为延迟性CINV的唯一病因——化疗药物目前仅用于肿瘤患者。这类人群具有其体质特殊性。研究表明：100%癌症患者具有焦虑、抑郁、担心等负面压抑的心理困扰，其中81%的患者心理困扰程度为中重度[8]。中医学认为人是形神一体，负面压抑的心理特质会直接影响形体脏腑。肝主情志，性喜调达，在负面压抑的情志影响下，肝气无以升发而郁滞化火。肝气郁而化火，肝胃不和，而胃气上逆发为呕吐。综上所述，延迟性CINV的证型为肝郁脾虚的特殊证型。

针对这种特殊证型，丁郁柿蒂汤在延迟性CINV中可以发挥良好疗效。丁郁柿蒂汤中丁香柿蒂汤温中健脾益气、降逆止呕，配伍郁金疏肝理气，清泻肝火。甘草甘，补中焦，与人参、生姜共同发挥温健脾胃、补中益气，防止丁香和郁金芳香苦寒耗伤脾胃之气。虽然丁香与郁金是相畏药物，但据文献研究报道丁香、郁金配伍治疗呃逆呕吐疗效显著。如刘金梅等[3]拟方丁香郁金柿蒂汤用于治疗顽固性呃逆；周英信等[9]拟方丁香郁金散用于治疗顽固性呃逆。丁香、郁金两者相畏与郁金苦寒易损伤脾胃相关。丁香辛温，多用于治疗胃寒呃逆。若是单纯的胃寒呃逆运用丁香配伍郁金，郁金损伤脾胃更加重病情。有研究[10]发现，郁金能减弱丁香挥发油抑制小鼠胃排空的作用，此表明单纯配伍丁香与郁金，郁金能减弱丁香降逆止呕的功效。丁香温中焦而降逆止呕；郁金苦寒且与丁香同属芳香类药物，能耗能散，与丁香同用，因其易伤中焦阳气，故而郁金能减弱丁香降逆止呕之功，甚而因伤脾胃而发生呕吐、气虚而喘等。但是中医用药当辨证论治，不能单纯考虑二药合用的药理作用，如果失去了证，那么处方也就无以为据了。针对不同的证，中药处方具有不同的用药思路与方法。丁香与郁金相畏，但是丁香与郁金并不是绝对的配伍禁忌[11]。丁香配伍郁金不可用于单纯脾虚胃失和降的呕吐，但是针对延迟性CINV的肝郁脾虚证，两者一温一寒，丁香可温脾胃而防苦寒伤脾；郁金可疏肝之气，泻肝之火，土得木乃达而脾气健运，又可助丁香升运脾而和胃降逆。

在本研究中，丁郁柿蒂汤干预延迟性 CINV 后，丁郁柿蒂汤组大鼠高岭土食用量随时间逐步稳定下降，从第48小时开始食用量明显低于阿瑞匹坦组，疗效显著，并且未见大鼠出现毒性反应。郁金组单纯运用郁金干预延迟性CINV，大鼠呕吐加重，在36 h 高岭土食用量降低，出现大便稀溏，这与持续运用郁金伤脾胃之气，脾胃虚极而无以升举上逆发为呕吐相关。郁金组大鼠血清、回肠中SP均明显升高，回肠中PPTA mRNA、NK-1受体mRNA的表达均明显升高，文献研究表明脾虚时外周(血、回肠)SP升高[12]，这佐证了郁金组大鼠脾胃虚弱。而延髓中SP含量、PPTA mRNA、NK-1受体mRNA的表达明显降低，笔者未查阅到关于脾虚时延髓中SP含量变化的文献研究，这有待进一步研究证实。郁金组大鼠延髓中SP含量的降低与大鼠呕吐程度相符。延髓作为呕吐中枢，SP传导的呕吐冲动需经其而发挥作用，郁金组大鼠延髓中SP含量相对降低，因此郁金组大鼠呕吐程度降低。上述结果佐证了郁金损伤脾胃，将其单独用于肝郁脾虚呕吐会加重病情，而郁金与丁香配伍干预脾虚证可取得良好疗效。丁郁柿蒂汤干预延迟性CINV具有减毒增效的功能。

SP是CINV发生的主要递质之一，呕吐冲动通过SP传导至呕吐中枢，发出呕吐行为[13]；SP又是关键性神经递质[2]，与NK-1受体一同在延迟性CINV中起主导作用。本研究结果显示：与模型对照组对比，丁郁柿蒂汤组SP的降低最为显著。这表明：经过丁郁柿蒂汤干预，大鼠SP含量在外周及呕吐中枢降低。结果提示：丁郁柿蒂汤防治延迟性CINV的作用机制与减少SP的表达相关。PPTA是SP的合成前体[14]。PPTA 基因经转录成为PPTA mRNA后再经过翻译、加工合成SP[15]。因此，PPTA的表达异常必然会引起SP表达异常。本研究结果显示：与模型对照组对比，丁郁柿蒂汤组PPTA mRNA表达降低最为显著。结果表明：丁郁柿蒂汤在防治CINV过程中降低了PPTA mRNA的表达。提示：丁郁柿蒂汤通过抑制PPTA mRNA的表达减少SP的含量以治疗延迟性CINV。NK-1受体是与SP亲和力最大的受体，且与SP的分布大致相同[16]，又被称为 P 物质受体。SP与NK-1受体结合，才能将呕吐冲动传导至呕吐中枢，引发呕吐。本研究结果显示：与模型对照组对比，丁郁柿蒂汤组NK-1受体mRNA表达的降低最为显著。表明：丁郁柿蒂汤组NK-1受体mRNA表达的降低。提示：丁郁柿蒂汤能够通过抑制NK-1受体mRNA的表达以减少与SP结合的NK-1受体，达到防治延迟性CINV的目的。

综上所述，丁郁柿蒂汤干预延迟性CINV的作用机制与抑制PPTA mRNA表达、降低SP的含量并抑制NK-1受体mRNA表达相关。