免核酸提取荧光定量PCR方法应用研究

魏园园

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164）

分子检测方法由于具有的高敏感性、高通量和适合的价格，越来越频繁的应用在兽医诊断中。在检测过程中，常需要对检测样本进行核酸提取纯化，需要投入大量的时间，其复杂的提取步骤容易造成交叉污染。为能更加快速准确的进行疫病检测，免核酸提取产品成为了疫病检测的最佳选项。本文通过对禽流感病毒培养物、临床样本中的病毒核酸进行研究，用以评价免核酸提取与常规核酸提取两者在阳性符合率、病毒复制、检测效果等方面的差异，为临床疫病检测监控提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本

样本采集方法：用无菌棉拭子探入喉头口及上颚裂来回刮3～5次取咽喉分泌液，放入加有无菌1 毫升PBS缓冲液的无菌1.5 毫升离心管中备用。样本来源：全省抽取的5000例家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子、禽流感H5、H7、H9病毒培养样本各选取1例。

1.2 试剂与方法

1.2.1 常规荧光定量PCR检测法 使用天根生化科技（北京）有限公司的磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒，配套赛默飞KingFisher Flex全自动核酸提取仪对病毒培养物样本、稀释的病毒培养物样本、临床样本进行核酸提取制备，提取时间为40～60分钟。核酸提取完毕后，用QIAGEN的禽流感 H5/H7/H9荧光定量PCR试剂盒，对病毒培养物核酸、稀释的病毒培养物核酸、临床样本核酸进行荧光定量聚合酶链式反应（PCR法）检测；将上述处理好的核酸样本加样上机，用ABI7500荧光定量P C R仪进行扩增，收集荧光信号，进行结果判定。本阶段时间为90分钟。整个实验整体完成时间为130～150分钟。

1.2.2 免提取荧光定量P C R检测法 使用北京大有泰莱生物技术有限公司的禽流感H5/H7/H9免提取荧光定量PCR试剂盒，对病毒培养物核酸、稀释的病毒培养物核酸、确诊的临床阳性样本核酸进行荧光定量PCR方法进行检测；用试剂盒配套的样本处理液将样本进行待检处理，直接加样上机，用赛默飞ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增，收集荧光信号，进行结果判定。本阶段时间为100分钟。整个实验整体完成时间为105～110分钟。

2 实验结果

2.1 常规荧光定量PCR和免提取荧光定量PCR对病毒培养物检测结果对比

对于H5、H7和H9病毒培养物样本，根据100、10-1、10-2、10-3和10-4的稀释倍数，分别进行病毒核酸检测，免提取荧光定量PCR检测结果和传统荧光定量PCR检测结果一致，符合率100%。检测数据结果见表1。

结果表明高病毒浓度的病毒培养物、低病毒浓度的病毒培养物，免核酸提取方法均能满足准确检测判定的需求。

2.2 常规荧光定量PCR和免提取荧光定量PCR对临床样本的检测结果

对5 0 0 0份临床样本，用QIAGEN的常规荧光荧光定量PCR试剂盒检测，样本阴阳性判定结果见表2。

确诊为阳性样本的，再根据100、10-1、10-2和10-3的稀释倍数，分别进行H5、H9病毒检测，其阳性符合率依然一致。检测数据见表3。

表1

结果表明高病毒浓度的临床样本、低病毒浓度的临床样本，免提取的荧光定量PCR试剂均能满足准确检测判定的需求。

应用免核酸提取方法对禽流感病毒H5/H7/H9亚型的病毒培养物、稀释的病毒培养物、临床阳性样本、稀释的临床弱阳性样本进行检测。检测结果与常规核酸提取荧光定量PCR检测方法结果一致，可以满足禽流感病毒H5/H7/H9亚型的病毒检测需求。综上所述，免核酸提取荧光定量PCR方法检测的阳性复合率100%符合，且可以有效的提高实验效率，此方法可以有效应用于动物疫病临床监测。