山柰挥发油胃内滞留型给药系统对胃肿瘤治疗的作用机理研究

涂 云

胃肿瘤是最常见的肿瘤之一，是目前已发现的世界上最致命的肿瘤[1-2]。我国是胃癌高发地区，人口基数大，胃癌患者数不胜数，因此在胃癌诊治上，目前还是不能完全满足患者的诊治需求，胃癌治疗面临着巨大的挑战[3]。虽然近些年来肿瘤的治疗已经取得一定的进步，由于胃切除后局部复发率较高，对患者而言并非最佳治疗方式[4]。除此之外，胃肿瘤的预后和诊断目前还是仍相对较差[5]。山柰挥发油是1种新型的广谱抗癌药物，研究表明山柰挥发油能够影响DNA合成从而干扰细胞分裂[6-8]。山柰挥发油可以延长其生存期，而且体内甲胎蛋白(AFP)表达也会下降，从而使瘤体质地变软，体积回缩[9]。使用山奈酚和山柰挥发油后，癌灶会稳定或者缩小，还能缓解疼痛并且改善患者的进食；提高患者的免疫力，不产生骨髓抑制，治疗后患者的白细胞有升高的趋势[10-11]。胃内滞留型给药是1种靶向治疗，靶向治疗是1肿瘤细胞过度表的某些分子为靶点，选择针对性的阻断剂，有效的调控于肿瘤发生密切相关的信号，从而达到抑制肿瘤生长，进展及转移的效果[12]。本实验采用体外滞留型靶向给药方式，通过用不同剂量药物浓度处理胃癌细胞SGC-7901，然后检测胃癌细胞增殖、凋亡情况，并观察经过药物处理后胃癌细胞中COX-2和AFP的蛋白表达，从而探讨山柰挥发油靶向给药对胃癌治疗的作用，为胃癌治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RPMI 1640高糖培养基(杭州四季青生物工程有限公司，KGM31800S-500)；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(凯基生物有限公司，20170101)；青霉素链霉素混合液(索莱宝科技有限公司， 20160909)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，BI生物有限公司，1552680)；β-actin(中杉金桥，TA-09，1∶2 000)； COX-2(Cell Signaling，#12282，1∶1 000) ;AFP(abcom，ab133617，1∶50 000);迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；荧光定量PCR仪，荧光显微镜，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；TE2000荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养

SGC-7901胃癌细胞购于中国科学院上海细胞库，当细胞的融合度达到90%以上时，弃去培养液，再用PBS洗2次，然后加入胰蛋白酶消化2 min，加入含10%FBS的1640，最后将细胞吹打下来并吸取到10 ml离心管中，离心，弃上清，注意不要碰到管口，加入1640完全培养基并接种到2个新的10 mm培养皿中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养。

1.3 MTT检测

在96孔板加入细胞100 μl/孔(约2×103个)，置37 ℃5%CO2细胞培养箱培养24 h，加入山柰挥发油，然后置于37 ℃5%CO2细胞培养箱孵育48 h。将5×MTT用Dilution Buffer稀释成1×MTT，每孔加50 μl 1×MTT，在37 ℃孵育4 h，使MTT还原为甲臢。吸出上清液，每孔加150 μl DMSO使甲臢溶解，用平板摇床摇匀。酶标仪在550 nm波长处检测每孔的光密度。

1.4 流式检测细胞凋亡

将细胞接种于6孔板，当细胞汇合度达到50%～70%时，在低剂量处理组和高剂量处理组中分别加入对应浓度的药物，然后置于37 ℃5%CO2细胞培养箱。48 h后，消化收集细胞，避光染色30 min上机检测。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的方法，在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.5 流式检测细胞周期

取生长状态良好的对数生长期的细胞，每孔按4×103个接种至12孔板中，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞转染和加药物处理，继续培养48 h后，PBS洗细胞2次，加70%乙醇固定，用流式检测仪检测细胞周期。

1.6 Western blot检测

取SGC-7901细胞加入相应的裂解液，4 ℃裂解30 min，在10 000 rpm/min离心10 min，小心吸取上清，即得总蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1～2 h，湿法转膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液过夜；室温孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

1.7 qPCR检测

取SGC-7901细胞进行RNA的提取，提取RNA后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，算出各组组织中的COX-2、AFP表达量。引物序列如下：COX-2 F：TCAAATGAGATTGTGGGAAAATTG；COX-2 R：TCTAGTAGAGACGGACTCATAGAA；AFP F：CTGTTGCTGCCTTTGTTTGGA；AFP R：CTTCTTTGGGCTGCTCGCTAT；GAPDH F：CAATGACCCCTTCATTGACC；GAPDH R：GAGAAGCTTCCCGTTCTCAG。

1.8 统计学分析

所有数据均应用SPSS 19.0统计分析，用表示，经t检验显著性差异，以P<0.05作为显著性差异。

2 结果

2.1 MTT检测细胞增殖

如图1所示，与对照组相比，药物处理组细胞增殖率明显降低，同时，高剂量处理组相比低剂量处理组，细胞增殖率更低，有统计学差异。

图1 MTT检测细胞增殖

2.2 流式检测细胞凋亡

如图2所示，与对照组相比，药物处理组凋亡率明显增高，随着药物浓度增加，细胞凋亡率也增加。

图2 流式检测凋亡

2.3 流式检测细胞周期

将低剂量和高剂量药物分别加入细胞中，检测对细胞周期的影响，经分析，各组G1和S所占比例皆有所变化，随着药物浓度的增加，G1期加长，S期缩短，G2期变化不是很显著，见表1。

表1 流式检测细胞周期/%

2.4 Western blot 检测

如图3所示，与对照组相比，低剂量药物组和高剂量药物组细胞中COX-2和AFP蛋白的表达都有所下调，且随着给药浓度升高，表达量越低，有统计学差异。

2.5 荧光PCR检测

如图4所示，与对照组相比，低剂量药物组和高剂量药物组细胞中COX-2和AFP基因的表达都有所下调，且随着给药浓度升高，表达量越低，有统计学差异。

3 讨论

我国胃癌死亡率较高，化疗是目前癌症治疗主要手段，胃切除也是在胃癌治疗的1种治疗手段，但是化疗后便会带来食欲缺乏、毛发脱落和血细胞减少等副作用，而胃切除则因复发率较高而不能被广泛使用。若使用普通抗癌药，用药后全身分布，也有较大的毒副作用。为解决癌症治疗中这一系列问题，近年来，使用天然产物药物被认为是预防和治疗癌症疾病的新型治疗策略。山奈酚和山柰挥发油是1种存在于不同植物物种中的天然黄酮醇，被认为具有抗炎性质，许多植物性食品和草药中皆含有这些成分[13]。此外，多项研究表明，山柰酚和山柰挥发油可以抑制人类癌细胞株的生长和诱导细胞凋亡[14]。本实验通过MTT检测胃癌细胞的存活率，结果表明，山柰挥发油能够抑制细胞的增殖，且随着山柰挥发油药物浓度的升高，细胞存活率明显降低。流式检测细胞凋亡的结果也证实了山柰挥发油对细胞凋亡起着促进作用。流式检测周期结果显示，给药后，细胞分裂受阻，滞留在S期和G2期。靶向给药系统能将药物定向输送到靶器官，通过作用于体内特定的肿瘤细胞，减少了药物对正常组织的影响，而且药物直接作用在特定位置，减少药效分散，因此给药时可以降低剂量，降低了药物的毒副作用。因此靶向治疗为肿瘤患者带来了巨大的希望[15]。本实验以新型抗癌药为模型，利用被动靶向的机理，直接将药物加入胃癌细胞，研究其作为靶向治疗胃癌的可行性。实验材料易得，且无需昂贵实验设备，便能研究目的药物对胃癌细胞的影响。COX-2即环氧合酶2，关于乳腺癌、结肠癌等各种癌症的研究表明，该基因和蛋白在癌细胞中都是高表达[16-17]。对照组中COX-2的表达量也证实了其在胃癌中一样是高表达。然而在加入不同剂量的山柰挥发油药物处理后，COX-2的表达呈现下调趋势，与低剂量组相比，高剂量组中的COX-2表达更低。早期研究表明，甲胎蛋白(AFP)在胃癌细胞分化中起着重要作用，不含AFP的胃癌细胞相比，产生AFP的胃癌更具侵略性，侵袭作用和转移能力更强，并表明如要抑制AFP的产生，最佳方式是个体化用药，即本实验中的靶向用药[18]。本实验通过检测给药组和对照组中AFP的基因和蛋白表达，PCR和Western blot两项实验结果皆证明，加入药物后，AFP表达下调，尤其是高剂量药物处理组，下调趋势更加明显。因此证明，山柰挥发油可以抑制AFP的产生和表达，同时也证明靶向用药确实对AFP的产生和表达影响较大。为以后新药研发和胃癌治疗奠定了理论基础。

综上所述，山柰挥发油可以抑制胃癌细胞的分裂、增殖和扩散，促进胃癌细胞凋亡，并影响细胞中相关蛋白的表达。结果证实，胃癌的靶向治疗，是胃癌治疗的1种新的技术，是对胃癌患者有更好的康复希望。胃癌早期及时的靶向治疗，对患者的康复作用很大。

图3 Western blot 检测COX-2、AFP表达

图4 PCR检测COX-2和AFP基因表达