酶辅助水蒸气蒸馏法提取兴安落叶松针叶精油工艺

徐兴堂，张子东，王玉红

(1.黑龙江省带岭林业科学研究所，黑龙江 带岭 153106 ;2.东北林业大学 森林植物生态学教育部重点试验室，哈尔滨 150040)

松科落叶松属落叶松〔Larixgmelinii(Rupr.) Kuzen〕是我国东北林区的主要森林树种，分布于大、小兴安岭海拔300～1 200m地带，苏联远东地区也有分布，叶为倒披针状条形(针叶)，富含精油[1]。植物精油是植物新陈代谢的此生产物，可以通过水蒸气蒸馏法蒸馏等方法提取。松针是对松科常绿乔木针叶的统称，可提取出精油。松针精油具有清香、果香、木香、药草香，且具有抑菌、杀虫等生物活性。

1 试验材料、仪器及试剂

兴安落叶松鲜针叶( 采集自黑龙江省伊春市带岭区东山种子园)，纤维素内切酶(济宁和信技术有限公司)，纤维素外切酶(济宁和信技术有限公司)，半纤维素酶(Sigma ，USA)，电子控温，浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)，电子控温加热套(天津泰斯特仪器有限公司)，磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)，三重四极杆串联气质联用仪(Agilent Technologies，USA)，紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)，无水硫酸钠(天津恒兴化学试剂有限公司)，氢氧化钠(天津致远化学试剂有限公司)，冰醋酸(天津致远化学试剂有限公司)，无水乙醇(天津天力化学试剂有限公司)，羟甲基纤维素钠(CMC)(天津致远化学试剂有限公司)，葡萄糖标准品(Sigma，USA)，3，5-硝基水杨酸(DNS试剂)(上海季蓝生物有限公司)，酒石酸钾钠 (天津市光复科技发展有限公司)，结晶酚(天津天力化学试剂有限公司)，醋酸钠(天津致远化学试剂有限公司)。

2 试验方法

2.1 酶活测定

吸取稀释酶液(吸取1.0mL酶液，精确到0.01mL，准确稀释定容)与1.8mL 1%的CMC溶液加入具塞刻度试管混匀，50℃水浴加热60min，水浴加热完成后取出待其冷却，加入DNS试剂2mL，摇匀后立即沸水浴加热10min，冷却后用蒸馏水定容至25mL；稀释酶液中加入1.8mL醋酸缓冲溶液，不加入CMC其他步骤同上，作为空白用于调零，550nm下测OD值。平行3次测定取其平均值，代入葡萄糖标准曲线的回归方程得出含量，按式1计算酶活(U/g)[2]。

式1中：5.56为1mg葡萄糖的μmol数。

2.2 原料酶预处理及精油的提取

取100g自然干燥后粉碎的兴安落叶松针叶放入2 000mL的蒸馏烧瓶中，按料液比1∶10加入蒸馏水，分为5组。5组分别为添加100U半纤维素酶组，纤维素内切酶组，纤维素外切酶组，混合酶(半纤维素∶纤维素外切酶=1∶1)组及不添加任何酶组的对照空白组。将装好的蒸馏烧瓶固定在50℃的恒温水浴锅中，搅拌60 min后，进行水蒸气蒸馏提取，即加热至沸腾开始计时120min。获得的精油冷却至室温，记录体积。将精油装入密封的玻璃瓶中，4℃保存，备用。进行3次重复试验，计算兴安落叶松针叶精油得率。

2.3 兴安落叶松针叶精油气相质谱(GC-MS)分析方法

安捷伦7000A三重四极杆串联气质联用仪气相条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱，进样口温度280℃，初始柱温50℃，以3℃/min升至140℃，保持10min，以15℃/min升至215℃，以5℃/min升至260℃，保持2min。载气为高纯氦气，分流比为40∶1，进样量1μL。电子轰击离子源(EI)温度：230℃，接口温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围30～500aum，溶剂延迟时间为3.75min。

2.4 酶辅助提取兴安落叶松针叶精油

经上述试验计算得到的不同酶预处理后提取兴安落叶松针叶精油的得率，其最大值所对应的酶用于单因素试验。酶解时间、酶解温度和pH值是酶解过程中的重要因素，因此对其进行单因素试验，确定酶解反应的最佳条件。

2.4.1 酶解pH值。将100U的酶溶于pH分别为3、4、5、6的1 000mL水中，加入装有100g兴安落叶松针叶的蒸馏烧瓶中，于50℃水浴锅中进行酶预处理60 min，间歇搅拌。酶解后进行水蒸气蒸馏提取，120 min后油水分离，冷却至室温经3 500 r/min离心10 min，取上层加入无水硫酸钠脱水得兴安落叶松针叶精油。平行测定3次，计算兴安落叶松针叶精油得率，确定最适pH值。

2.4.2 酶解时间。将100U酶溶于pH值为5的1 000mL水中，加入装有100g兴安落叶松针叶的蒸馏烧瓶中，于50℃水浴锅中进行酶预处理，酶解时间分别选取为30min、60min、90min、120min，间歇搅拌。酶解后进行水蒸气蒸馏，120min后油水分离，冷却至室温经3 500r/min离心10min，取上层加入无水硫酸钠脱水得兴安落叶松针叶精油。平行测定3次，计算兴安落叶松针叶精油得率，确定酶解作用时间。

2.4.3 酶解温度。将100U的酶溶于pH值为5的1000mL水中，加入装有100g兴安落叶松针叶的蒸馏烧瓶中，于30、40、50、60℃的恒温水浴条件下进行酶预处理90min，间歇搅拌。酶解后进行水蒸气蒸馏提取，120min后油水分离，冷却至室温经3500r/min离心10min，取上层加入无水硫酸钠脱水得兴安落叶松针叶精油。平行测定3次，计算兴安落叶松针叶精油得率，确定酶解作用温度。

3 试验结果

3.1 酶的活力

对3种酶的酶活力的测定的结果为：半纤维素酶、纤维素外切酶和纤维素内切酶的活力分别为2160.28U/g、2432.72U/g和2465.12U/g。

3.2 兴安落叶松针叶精油的提取率

表1 不同酶预处理提取兴安落叶松针叶精油量

由不同酶预处理提取兴安落叶松针叶精油量(表1)可知：经酶预处理的精油提取率为1.23%，酶辅助方法提取精油的量明显增加。不同的酶预处理后提取精油量也有所差异，其中，混合酶的效果最好，提取率为1.70%，比对照提高了38.2%，可见兴安落叶松针叶经酶预处理后更有利于精油的提取。

3.3 兴安落叶松针叶精油成分分析

由不同酶预处理后提取兴安落叶松针叶精油的成分及含量(表2)与不同酶预处理后提取兴安落叶松针叶精油成分(表3)可知：经5种预处理后的兴安落叶松针叶精油中被鉴定出33种成分、.其中含量大于1%的主要成分分别有24、23、24、24和24种，含量大于10%的主要成分分别有2、3、2、2和3种；采用峰面积归一法计算所含各成分的相对含量百分比，精油中大于1%的主要成分89.117%、88.736%、89.752%、89.516%和90.406%。由此可见，酶预处理组与未经酶预处理组比较，主要成分相差不大。

表2 不同酶预处理后提取兴安落叶松针叶精油的成分及含量

注：A：未经酶预处理，B: 经半纤维素酶预处理， C：经纤维素外切酶预处理， D：经纤维素内切酶预处理， E：经混合酶(纤维素外切酶∶半纤维酶=1∶1)预处理。

表3 酶预处理后的兴安落叶松针叶精油中主要成分的种类

注：A：未经酶预处理， B：经半纤维素酶预处理， C：经纤维素外切酶预处理， D：经纤维素内切酶预处理， E：经混合酶(纤维素外切酶∶半纤维酶=1∶1)预处理。

3.4 酶辅助提取兴安落叶松针叶精油工艺优化

3.4.1 pH值

由pH值对兴安落叶松针叶精油得率的影响(图1)可知：当pH值=5时，兴安落叶松针叶精油得率最高；当pH值<5时，精油得率随pH值的降低而降低；pH值>5时，精油得率随pH值的增加而降低。这是由于混合酶的活性受到pH值的影响，pH = 5时混合酶可以最大限度的破环β-1，4糖苷键消溶细胞壁。由于细胞壁的损伤程度逐步提高，有效物质溶出阻力降低，故此时兴安落叶松针叶精油得率最高。

图1 pH值对兴安落叶松针叶精油得率的影响

3.4.2 酶解作用时间

由酶解时间对兴安落叶松针叶精油得率的影响(图2)可知：兴安落叶松松针的酶解过程90min基本完成，当酶解反应在30～90min时，精油得率明显上升，而在90min之后，精油得率无太大变化。因此，最佳酶解时间为90min。因酶解反应必须持续一定的时间，但酶解时间过长可能会导致酶与溶出物发生了反应或有效成分溶出受到酶解产物的阻碍，而使溶出率降低。

图2 酶解时间对兴安落叶松针叶精油得率的影响

3.4.3 酶解温度

由酶解温度对兴安落叶松针叶精油得率的影响(图3)可知：当温度<50℃时，精油得率随着温度的升高而增加，而当温度>50℃后，精油得率反而降低。因此，最佳酶解温度为50℃。由于酶的本质是蛋白质大分子化合物，故温度超过酶解最适温度范围就会使酶逐步变性，酶的立体构象与活力位点发生改变使酶活力的下降或丧失，从而影响混合酶对兴安落叶松针叶叶的酶解效果，不利于兴安落叶松针叶精油的提取。

图3 酶解温度对兴安落叶松针叶精油得率的影响

4 结论

4.1 本研究采用酶辅助-水蒸气蒸馏法提取兴安落叶松针叶精油。采用半纤维素、纤维素外切酶、纤维素内切酶及混合酶(纤维素外切酶∶半纤维素酶=1∶1)对兴安落叶松针叶预处理后提取其精油，其结果表明：混合酶组预处理后提取精油量最高，经酶预处理的兴安落叶松针叶精油提取率比未经酶预处理组提高了38.2%，这对大规模工业化云杉精油的提取意义重大。经过GC-MS分析，未经酶预处理组与酶预处理组提取的兴安落叶松针叶精油，在相同气质条件下，进行分析鉴定，精油组成和主要成分含量未没有明显变化，这表明在精油得率提高的同时并未影响精油的品质。

4.2 对提取兴安落叶松针叶精油的预处理条件进行单因素试验研究，得到最佳提取工艺条件，当pH值为5、酶解时间为90min、酶解温度为50℃，兴安落叶松针叶精油得率最高，为1.70%。提取工艺条件可靠，并可以为其它植物精油的提取提供新的方法和理论依据。