苹果砧木组培苗的脱毒与检测

宋正旭，马荣群，黄粤

（青岛市农业科学研究院，山东 青岛 266100）

苹果是多年生木本植物，生长过程中会遭受多种病毒的侵染，使得树体生长势减弱，直接影响产量和品质，严重地可造成植株死亡。目前危害较严重的病毒种类主要有苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）以及苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）等[1]。种植无病毒苗木是防治病毒病的最根本途径，本试验对课题组优选的13个苹果砧木资源进行病毒脱除处理，并检测脱毒效果，以期为生产提供更多无病毒苹果砧木优良苗木。

1 材料与方法

1.1 供试材料

课题组保存的苹果品种及砧木材料：HCT-1、HCT-2、E、M26-1、M26-2、TM7-1、JM7-2、BP、H0、ME-2、W8N13、71-3-150、唐木田共13份材料。

1.2 试验方法

1.2.1 脱毒处理方法

于4、5月份大田植株旺盛生长期，取快速生长的新梢，室内消毒，在超净工作台内解剖镜下剥取1～2mm的茎尖接种于分化培养基上，诱导茎尖分化成苗，分化出的植株经增殖培养获得大量继代苗，将在增殖培养基上培养20d左右的瓶苗放入培养箱进行变温热处理，培养条件为38℃光照8h，32℃黑暗下16h，培养40d后切取茎尖于继代培养基上继续培养，成苗后进行病毒检测[2]。

1.2.2 病毒检测

脱毒处理后的组培苗参考郝璐等[3]的方法进行病毒检测。共检测 13 个样品，HCT-1、HCT-2、E、M26-1、M26-2、TM7-1、JM7-2、BP、H0、ME-2、W8N13、71-3-150和唐木田。

检测方法：共对13个苹果样品采样进行检测，检测的病毒为 ASGV、ASPV、ACLSV、Apscaviroid。采用 SiO2吸附法提取RNA，Random Primer进行反转录。

2 结果与分析

图1 内参基因及4种病毒、类病毒的电泳图谱Fig.1 Electrophoresis of intrinsic reference genes and 4 viruses

由图1及表1（见下页）可知，第8、11、13号材料含有ASGV；第2、8、11号材料含有ACLSV；第10号材料含有Apscaviroid。即BP、W8N13、唐木田含有苹果茎沟病毒；HCT-2、BP、W8N13 含有苹果褪绿叶斑病毒；ME-2 含有苹果锈果类病毒；所检样品均未检出苹果茎痘病毒。苹果品种E、M26、JM7、H0和71-3-150等砧木通过春季旺盛生长期取材结合茎尖培养即可脱除所携带的病毒，这可能因为春季果树旺盛生长期新梢的生长速度远高于病毒繁殖的速度，使得顶芽新梢部位不含病毒或病毒含量极少，再结合茎尖培养技术，即可脱除绝大部分病毒。材料HCT茎尖培养获得再生植株依然携带ACLSV，进一步进行高温处理即可将ACLSV脱除干净，而唐木田和ME茎尖培养结合高温处理仍有部分病毒不能脱除。

表1 供试材料中四种病毒类病毒的携带情况Table 1 Portability of four viruses in the test materials

由此可见，取材时期对苹果病毒的脱除效果影响极大，后期的高温处理对于病毒的进一步脱除也有一定的贡献。上述四种病毒，苹果茎痘病毒相较其他三种病毒更易脱除，而供试材料E、M26、JM7、H0和71-3-150等苹果砧木更易获得无病毒植株。

3 结论

种植无病毒苗木是防治果树病毒病的最根本途径，本试验对课题组现有苹果砧木资源进行病毒脱除并检测脱毒效果，结果显示，使用RT-PCR检测脱毒处理后样品 BP、W8N13、唐木田含有 ASGV；HCT-2、BP、W8N13 含有ACLSV；ME-2含有Apscaviroid；所检样品均未检出ASPV。试验获得5份无病毒苹果砧木组培苗。此外，试验还得出，苹果茎痘病毒相较其他三种病毒更易脱除，而供试材料E、M26、JM7、H0和71-3-150等苹果砧木更易获得无病毒植株。