血液肿瘤患者血浆EB病毒和巨细胞病毒定量检测的临床价值*

王海滨，张冬青，司英丽，赵 娇

(中国人民解放军总医院第一附属医院检验科，北京 100048)

EB病毒(EBV)是对人类有致癌潜能的一种γ疱疹病毒，主要侵袭人B淋巴细胞。免疫学、流行病学及分子生物学等方面研究表明，EBV感染与鼻咽癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、伯基特淋巴瘤等多种肿瘤的发生、发展密切相关[1]。巨细胞病毒(CMV)感染可累及消化道、中枢神经系统和肺等多种器官，在血液肿瘤移植患者中，CMV的感染率高达32%～45%，病死率可达75%～90%[2-3]。因此，准确、快速诊断EBV和CMV感染的方法在早期诊断和治疗中起到日益重要的作用。本研究应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对血液肿瘤患者血浆中EBV DNA和CMV DNA的水平变化进行观察，以探讨病毒水平的动态变化与患者病毒感染的预防、诊断与治疗的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年1月至2017年6月本院诊治的280例血液肿瘤患者。患者年龄3～85岁，中位年龄41岁，其中男161例、中位年龄40岁(3～78岁)，女119例、中位年龄46岁(3～85岁)。临床诊断为NHL 81例(28.9%),HL 27例(9.7%),急性淋巴细胞白血病(ALL)32例(11.4%),急性髓细胞白血病(AML)48例(17.1%),再生障碍性贫血(AA)43例(15.4%),多发性骨髓瘤(MM)23例(8.2%)，MDS 26例(9.3%)。所有患者经骨髓细胞形态学、细胞遗传学和免疫学确诊，符合《血液病诊断疗效与标准》[4]。其中进行外周造血干细胞移植的患者126例，患者中位年龄33岁(3～77岁)，其中男81例、中位年龄32岁(5～77岁)，女45例、中位年龄33岁(3～71岁)；临床诊断为NHL 15例(11.9%)，ALL 20例(15.9%)，AML 31例(24.6%)，AA 38例(30.1%)，MM 4例(3.2%)，MDS 18例(14.3%)。

1.2标本处理 抽取患者静脉血2 mL，应用乙二胺四乙酸二钾抗凝，血液标本3 500 r/min离心5 min后取血浆，置于4 ℃保存，24 h内检测完毕。

1.3实时荧光定量PCR 取100 μL血浆加入等量的DNA浓缩液充分混匀，12 000 r/min离心10 min后弃上清液，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混匀，100 ℃恒温处理10 min，12 000 r/min离心5 min后取上清液备用。EBV和CMV核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)均购自中山大学达安基因股份有限公司。应用实时荧光定量PCR技术检测血浆中病毒DNA拷贝数，PCR反应体系严格按照产品说明书进行。应用Roche公司Light Cycler®480实时荧光定量PCR仪进行检测，PCR反应条件为93 ℃，2 min；93 ℃，45 s，55 ℃，60 s，循环10次；93 ℃，30 s，55 ℃，45 s，循环30次，采集点选择在55 ℃，45 s，反应体系为45 μL。每次PCR反应均设置4个标准品(拷贝数数量级为107、106、105、104，用于制作标准曲线，以EBV为例，图1)，根据试剂盒说明书病毒DNA拷贝数>500 copy/mL定义为阳性结果。

图1 EBV病毒DNA的PCR标准扩增曲线

注：A为4个标准品病毒DNA的PCR扩增曲线；B为病毒DNA的PCR扩增标准曲线

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1血液肿瘤患者血浆EBV和CMV检测阳性率分布 280例血液肿瘤患者中EBV检测阳性的患者48例，阳性率为17.1%，CMV检测阳性的患者53例，阳性率为18.9%，动态监测病毒DNA拷贝数为102～107copy/mL，EBV和CMV检测同时阳性者25例，阳性率为8.9%。其中AA患者中EBV和CMV检测阳性率分别为27.9%和37.2%，见表1。

表1 血液肿瘤患者的EBV、CMV感染情况[n(%)]

2.2血液肿瘤患者中接受移植者的病毒感染情况 血液病患者中接受骨髓或外周造血干细胞移植的患者126例，其中EBV检测阳性的患者36例，阳性率为28.6%，EBV感染拷贝数为0～5×102copy/mL，EBV感染拷贝数最高为1.81×106copy/mL；CMV检测阳性的患者51例，阳性率为40.5%，CMV感染拷贝数为0～5×102copy/mL，CMV感染拷贝数最高为6.30×104copy/mL。EBV和CMV检测同时阳性者25例，阳性率为19.8%。

2.3接受移植者的临床特征及病毒感染情况 126例接受移植患者中共有36例(28.6%)发生EBV血症，其中男性患者EBV感染率稍高于女性患者(30.9%vs.24.4%，P>0.05)，ALL患者感染率稍高于其他疾病患者(P>0.05)，异体移植发生EBV血症的感染率为33.3%，自体移植患者并无EBV感染。所有患者中共有51例(40.5%)发生CMV血症，其中男性患者CMV感染率稍高于女性患者(44.4%vs.33.3%，P>0.05)，ALL患者感染率稍高于其他疾病患者(P>0.05)，异体移植发生CMV血症的感染率为47.2%，自体移植患者并无CMV感染。血液肿瘤患者接受移植者中13例患者EBV的PCR检测连续呈阳性，36例患者CMV的PCR检测连续呈阳性，给予更昔洛韦、阿昔洛韦、膦甲酸钠等抗病毒治疗，病毒感染进展为病毒性肺炎、脑炎、肠炎等疾病时，进行联合抗病毒治疗，同时增加免疫球蛋白以提高患者机体免疫力，患者均在抗病毒治疗7～14 d后转阴。其中有1例进行异基因造血干细胞移植后56 d出现EBV拷贝数升高，有1例进行异基因造血干细胞移植后85 d后出现EBV拷贝数升高，同时出现了移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)，发生率为1.59%(2/126)。126例血液肿瘤患者中共5例发生死亡，2例患者为多重感染导致败血症及呼吸衰竭，2例患者为重度移植物抗宿主病，1例患者出现移植后原发疾病复发。随访患者，本研究还发生的2例移植后PTLD，发生率为1.59%。见表2。

表2 126例造血干细胞移植患者的临床特征及病毒感染情况[n(%)]

注：死亡者中有1例既有EBV感染又有CMV感染

3 讨 论

血液恶性肿瘤的发病率在世界范围内逐年递增，严重危害人类健康，随着临床诊疗水平的提高，造血干细胞移植目前逐渐成为治疗血液疾病的有效手段，使血液肿瘤患者造血系统和免疫系统重建，但是移植后的并发症是影响移植成败的关键因素。由于免疫重建缓慢及免疫抑制剂的应用等原因，使血液肿瘤患者容易发生经输血及供者干细胞病毒感染，以及体内潜伏的病毒复燃[5-6]，其中EBV和CMV感染是威胁患者临床疗效和生存的重要并发症之一。EBV和CMV的传统血清学检测虽然简便快速，但是敏感性较差，无法提供患者现症感染的临床资料，应用实时荧光定量PCR技术检测血浆EBV DNA和CMV DNA，比常规PCR技术灵敏度更高，能够更为精确地反映患者EBV和CMV感染的状态[7]。

据报道EBV人群易感性高，成人EBV血清学阳性率超过95%[8]，而成人血清CMV阳性率几乎为100%，即大部分人都存在既往感染。移植后与EBV感染相关的PTLD是少见但是致命的并发症[9]，单倍体移植患者移植后发生PTLD的危险性较高。本研究分析发现，移植后EBV的感染率为28.6%，男性患者EBV感染率稍高于女性患者，AA感染率高于其他疾病患者，其中PTLD的发生率为1.59%，较文献[10]报道低。CMV感染可以累及肝、肺、消化道等，CMV相关间质性肺炎早期诊断和治疗，可显著降低其病死率。本研究发现，移植后CMV的感染率为40.5%，男性患者CMV感染率稍高于女性患者，在CMV感染的患者中出现3例间质性肺炎，AA感染率高于其他疾病患者。动态监测患者病毒DNA拷贝数为102～107copy/mL，在所有患者中，EBV和CMV检测同时阳性者为25例，阳性率为19.8%。对PTLD高风险人群应警惕EBV感染的发生，在应用免疫抑制剂加量前应密切监测EBV DNA载量，建议定期复查EBV病毒载量，以及密切观察相关的临床表现。本研究发生的2例PTLD，由于临床早期识别，并进行及时干预，减少免疫抑制剂用量，应用抗病毒药物，患者预后良好。

综上所述，通过实时荧光定量PCR检测血液肿瘤患者血浆EBV DNA和CMV DNA水平有助于EBV和CMV感染的早期诊断和疗效判断，其检测灵敏度高，稳定性强。造血干细胞移植后患者移植前后病毒的预防及感染后的抗病毒治疗是非常必要而且有效的，使病毒载量降低并最终转阴，从而可以降低病死率。因此，血浆EBV DNA和CMV DNA检测具有重要的临床意义。