高效液相色谱-串联质谱法测定移植患者血浆泊沙康唑水平

王 磊，孙文利，刘红星

(河北燕达陆道培医院，河北廊坊 065201)

泊沙康唑是新一代三唑类广谱抗真菌药物，是被美国食品药品监督管理局批准用于预防侵袭性曲霉菌感染的一线药物，可用于13岁以上严重免疫抑制患者侵袭性真菌感染和念珠菌感染的预防和治疗[1]，还可用于无法耐受常用抗真菌药物成人患者的侵袭性曲霉病、镰刀菌病、慢性芽生菌病、分枝杆菌病和球孢子菌病的治疗[2]。侵袭性曲霉菌感染是移植患者最危险的并发症之一，病死率高，常推荐口服泊沙康唑预防感染。药物低暴露量与泊沙康唑临床疗效不佳密切相关，药物高暴露量则可增加药物的毒性反应。美国传染病学(IDSA)2007年更新的《组织胞浆病治疗指南》也指出，由于个体间变异和潜在的药物相互作用，测定稳态血药浓度有助于提高疗效[3-4]。多数研究认为泊沙康唑血浆谷值与抗真菌疗效最相关的药动学/药效学参数AUC24/MIC有较好的相关性[5-8]。因此，通过检测泊沙康唑血浆谷值可以有效提高用药的有效性与安全性，从而为临床合理使用泊沙康唑提供参考。目前，关于国内泊沙康唑血药浓度监测研究较少，可用于借鉴的方法更少，且检测方法多为色谱法。色谱法分析时间长，前处理繁琐，所需血样量多，污染大，而质谱法用于泊沙康唑血药浓度的检测耗时短，处理简单。因此，开发一种适合泊沙康唑血药浓度检测的质谱法用于临床血药浓度监测，就显得非常重要。本文作了这方面研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器 岛津20A高效液相色谱系统(带自动进样器)，配有AB Sciex 4000 QTRAP质谱仪，其林贝尔涡旋混合器，全自动高速冷冻离心机(Thermo Fisher)，Analyst V1.5.2工作站(AB公司)。

1.2试剂 甲醇(HPLC-Grade，fisher)、屈臣氏蒸馏水(广州屈臣氏)、甲酸(色谱级，Mreda Technology INC)、乙酸铵(色谱级，Mreda Technology INC)、泊沙康唑及泊沙康唑-d4(Standard Refrence Material from qcc.USA)。

1.3方法

1.3.1高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法的液相色谱及质谱条件 (1)色谱条件。采用Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×50.0 mm，5 μm)，柱温50 ℃；进样量3 μL；流动相A：0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相B：2 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸的水溶液。流速：0.800 0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，其中0.1～0.2 min，A相水平75%～90%，保持0.2 min，>0.2～0.5 min A相水平75%～90%，保持0.3 min，>0.5～0.9 min A相水平75%，保持2.1 min。(2)质谱条件。离子源：电喷雾电离源(ESI)；离子极性：正离子模式；扫描方式为多重反应监测(MRM)；喷雾电压(IS)：5 500.00；温度：425.00 ℃；源内气体1(GS1，N2)：55；气体2(GS2，N2)：55；气帘气体(CUR，N2)：20；碰撞气压力：中等；用于定量分析的离子反应为泊沙康唑m/z 701.5～683.4、泊沙康唑-d4 m/z 705.4～687.5。各种质谱条件参数见表1。

表1 质谱条件

1.3.2对照品贮备液的配制 精确称取对照品泊沙康唑10.00 mg，置于小烧杯中，用适量甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1 mg/mL泊沙康唑母液，作为贮备液。然后分别用甲醇水(1∶1)依次稀释母液，泊沙康唑对照品水平分别为1、5、10、25、50、75、100 μg/mL，作为系列标准工作液。

1.3.3样品处理方法 精密量取标本血浆100 μL置于1.5 mL 离心管中，然后加入2 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液100 μL，涡旋振荡1 min，再加入含有特定水平泊沙康唑-d4的甲醇800 μL，涡旋振荡1 min，于13 000 r/min离心10 min，取上清液170 μL置于自动进样器。

1.3.4标准曲线的制备 分别在7个1.5 mL 离心管中加入10 μL泊沙康唑各系列标准工作液，并加入空白血浆90 μL，得到泊沙康唑水平为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10 μg/mL系列质量浓度。按“1.3”项中样品处理方法处理后进样测定，以泊沙康唑峰面积与泊沙康唑-d4峰面积比为(Y)对泊沙康唑水平(X)进行线性回归，得泊沙康唑标准曲线。

1.3.5回收率、精密度试验 分别在3个1.5 mL离心管中加入泊沙康唑标准工作液5、10、50 μg/mL各10 μL，并加入空白血浆90 μL，得到泊沙康唑水平为0.5、1.0、5.0 μg/mL的样品。按“1.3”项中样品处理方法处理后进样测定，各水平日内重复测定5次，计算相对回收率及日内精密度，并连续测定5 d，计算日间精密度。

1.3.6稳定性试验 分别在3个1.5 mL离心管中加入泊沙康唑标准工作液5、10、50 μg/mL各10 μL，并加入空白血浆90 μL，得到泊沙康唑水平为0.5、1.0、5.0 μg/mL的样品。取1份样品按“1.3”项中血样处理方法处理后置于4 ℃冰箱中，于放置时间为72 h分别测定各样品的水平；其余样品于4 ℃冰箱中放置72 h后取出放至室温，按“1.3”项中样品处理方法处理后进样测定，考察其稳定性。

2 结 果

2.1色谱质谱行为 在“1.1”项下的色谱、质谱条件下，测得泊沙康唑及泊沙康唑-d4质谱图，见图1；泊沙康唑及泊沙康唑-d4的色谱图，见图2。由图2可知，血中没有物质干扰泊沙康唑的测定，泊沙康唑的保留时间为2.93 min，峰型良好，无杂质峰干扰。

图1 泊沙康唑、泊沙康唑-d4质谱图

注：A为泊沙康唑；B为泊沙康唑-d4

图2 泊沙康唑及泊沙康唑-d4色谱图

2.2标准曲线回归方程 泊沙康唑的回归方程：Y=1.11×105X+2.78×103，r=0.993 0，表明泊沙康唑在0.1～10.0 μg/mL范围内线性关系较好，可用于定量检测，其最低定量限为0.025 μg/mL。标准曲线见图3。

图3 泊沙康唑标准曲线

2.3方法学评价结果 泊沙康唑的相对回收率为90%～103%，日内及日间精密度均小于5%。见表2。

表2 回收率和精密度试验结果(n=5)

2.4稳定性考察结果 由表3可知，在4 ℃条件下，血中泊沙康唑放置72 h水平无明显下降；血样经过处理后，在4 ℃条件下，泊沙康唑放置72 h水平基本保持不变。由此可以得出，在此条件下测定血中泊沙康唑水平的稳定性良好，能保证测定结果的准确性。

表3 稳定性考察结果

2.5临床应用 收集2015年12月至2016年8月笔者所在医院检测泊沙康唑血药浓度的患者血浆标本50份，其中男23份，女27份；患者年龄1～66岁。标本采集时间为下次给药前，采集静脉血2 mL，混匀，EDTA抗凝。室温(20～25 ℃)下标本存放时间不超过4 h，当日检测。药物血药浓度结果见表4。HPLC-MS/MS法能满足临床对泊沙康唑血药浓度监测的需求，同时也可以反映出泊沙康唑临床应用血药浓度一般不会太高，很少产生明显毒性及严重不良反应；检测中血药浓度低值较多，达不到预防和治疗真菌感染的效果。

表4 血药浓度检测结果(n=50)

3 讨 论

泊沙康唑有明显药代动力学参数个体差异，口服泊沙康唑通过胃肠道吸收，但吸收具有饱和性。口服剂量小于800 mg时，其血药浓度和剂量呈线性关系，达到或超过800 mg 时吸收程度开始显著降低。泊沙康唑在体内的分布很广泛，口服给药5～8 h后达峰值血药浓度。泊沙康唑的血浆蛋白结合率很高(98.2%)，主要与清蛋白结合，所以一般血药浓度检测采用血浆。泊沙康唑几乎不通过肝细胞色素(CYP)酶系代谢，一般通过葡萄糖醛酸化反应代谢，但它可以明显抑制肝酶CYP3A4的活性，消除半衰期很长(超过35 h)，连续口服给药后7～10 d达稳态血药浓度[9]。移植患者免疫功能弱，容易感染[9-11]。侵袭性曲霉菌感染是移植患者最危险的并发症之一，病死率高，常推荐口服泊沙康唑预防该类患者的侵袭性曲霉菌感染[12]，建议其有效水平参考范围是0.5～5.0 μg/mL。最近研究指出，泊沙康唑用于预防真菌感染时，其血药浓度>0.70 μg/mL，最佳有效浓度靶值为1.25 μg/mL[2-9,13-16]。

本方案检测采用紫色试管(EDTA)，需采集约2 mL全血，离心取上清液，通过甲醇沉淀蛋白和萃取泊沙康唑，使泊沙康唑充分溶解于甲醇中。通过岛津LC-20A高效液相色谱进行分离和富集泊沙康唑，用AB Sciex 4000 QTRAP型质谱仪进行监测。同时，选用同位素泊沙康唑-d4作内标，进行定量，结果线性良好，回收率高，日内、日间精密度符合生物样本的分析要求，适于临床应用血药浓度监测。该处理方法简单、易操作和重复性好，避免了批间和样本间的系统误差，用于泊沙康唑的母体药物测定准确度高，特异性强[17-18]。