集菌涂片金胺“O”荧光染色法在检测痰液中抗酸杆菌的临床应用

樊晓东 陆兴热 张成伟 张青 资云菊 袁雕 叶树樱 王武满 朱德永 杨生仙 文山州人民医院 （云南 文山 663099）

内容提要： 目的：探讨金胺“O”荧光集菌染色法在检测痰液中抗酸杆菌的临床应用，为肺结核的早期快速诊断、治疗提供参考依据。方法：选择212例2016年6月～2017年12月感染科收治的疑似肺结核患者为研究对象，对其痰标本采取直接涂片和离心集菌涂片两种制片方法，用萋-尼氏抗酸染色法和金胺"O"荧光法进行染色镜检。结果：直接涂片抗酸染色法阳性率（9.43%，20/212）低于集菌涂片抗酸染色法（13.68%，29/212），直接涂片金胺“O”荧光染色法阳性率（17.45%，37/212）低于集菌涂片金胺“O”荧光染色法（36.32%，77/212），差异具有统计学意义（χ2=6.62，12.37，P=0.02，0.00）。集菌涂片抗酸染色法阳性率（13.68%，29/212）低于集菌涂片金胺“O”荧光染色法（36.32%，77/212），差异具有统计学意义（χ2=13.65，P=0.00）。金胺“O”荧光染色法的敏感度，特异性，约登指数及阳性、阴性预测值均优于萋-尼氏抗酸杆菌染色法，差异有显著性（P＜0.05）。结论：金胺“O”荧光集菌染色法是一种检测灵敏度高、特异性好、操作简便、快速的方法，对结核病患者的早期诊断和治疗具有重要意义。

结核病大部分就是肺结核，被视为威胁人民群众身体健康的传染病。现如今，我国每年新发结核病患者就占到了90万例，作为一个全球30个结核病高负担国家，在全球占到了第3位[1]。在我国，肺结核病人的诊断中广泛的应用了痰标本直接涂片法，该路径价格低廉、操作起来较为简单。同时也出现了其他的新方法，萋-尼氏抗酸染色法的特点就是阳性检出率低、镜检时间长；金胺“O”荧光染色的特点就是操作方便简单、极易分辨、时间短等。本研究借助金胺“O”荧光染色法以及抗酸染色法对疑似肺结核患者的痰标本展开检测，对痰标本中抗酸杆菌进行检测，对比分析两种方法的检测结果，给予临床应用依据。

1.材料与方法

1.1 标本来源

212 例标本来源于2016年6月～2017年12月感染科收治的疑似肺结核患者，入组样本为患者持续咳嗽、咳痰3周以上，有咯血或伴有血痰；发热或胸痛超过2周；胸部X线显示异常，临床诊断高度怀疑为肺结核病人的晨痰标本。合格痰标本应为血性、脓性、干酪样及黏液性痰，标本量≥2mL。其中男49例，女45例，年龄20～67岁，平均（45.9±12.3）岁。每份痰标本制备4张痰涂片，其中2张为直接痰涂片，2张为次氯酸钠液化离心沉淀集菌痰涂片。分为抗酸染色组和荧光染色组，每组由1张直接痰涂片和1张集菌痰涂片组成。

1.2 仪器与试剂

金胺“O”荧光染色液、萋-尼氏抗酸染液由珠海贝索生物技术有限公司提供、生物显微镜、日本奥林巴斯荧光显微镜、上海复星生物安全柜、清洁无油脂新玻片。

1.3 方法

借助竹签，将痰标本中脓样、干酪样或者血性挑取部分，大约0.05～0.1mL，在玻片正面右侧2/3中央处，均匀涂抹成痰膜朝上、厚薄适中的一个10mm×20mm的卵圆形痰膜，在生物安全柜中静置，打开紫外线灯照射15min（灭菌），室温下干燥后将痰涂片火焰固定。将剩余痰标本加等体积的5%次氯酸钠溶液，混匀后静置30min（液化、灭菌）[2]，倒入洁净离心试管中，震荡混匀后用离心机4000r/转离心15min[3]，去上清，留1mL沉渣混匀制成2张集菌痰涂片，涂片方法同直接涂片法。剩余沉渣保留备用。将制备好的痰涂片进行染色和镜检。①染色方法：染色严格按照试剂盒操作说明进行。抗酸染色组：将已固定的痰涂片滴加石碳酸复红溶液初染10min；水洗，沥水后滴加酸性酒精脱色1～2min或至无色；水洗，沥水后滴加亚甲基蓝溶液复染30s，水洗，晾干待检。荧光染色组：涂片固定后加金胺“O”染色液室温初染15min，水洗，沥水后用酸性酒精脱色1～2min或至无色，水洗，沥水后用高锰酸钾复染液复染3min，水洗晾干待检；②镜检：抗酸染色组：染色好的痰涂片用OLYMPUS CX21普通光学显微镜观察。用40×物镜观察细胞形态，使用100×油镜观察细菌细胞形态，每个标本仔细观察300个视野。荧光染色组：已染好的痰涂片用OLYMPUS荧光落射暗视野显微镜观察，镜检使用的是10×目镜、20×物镜，若是出现疑为抗酸杆菌的荧光杆状的物质，借助40×物镜展开确认。需要依据《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》来确保涂片镜检的质量，同时依据相关的程序和频度来实施[4]。痰涂片保存需要超过1年，以便上级结核病实验室展开接下来的质量控制复验。抗酸杆菌阳性：抗酸杆菌阳性（1+）：3～9条/100视野；抗酸杆菌菌数1～8条/300视野；抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/10视野；抗酸杆菌阳性（3+）：1～9条/1视野；抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/1视野。报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察100个视野，3+、4+时至少观察50个视野。萋-尼氏抗酸杆菌染色镜检结果分级标准：萋-尼氏染色抗酸杆菌阴性：对300个不同视野进行连续观察，没有出现抗酸杆菌；荧光染色镜检结果分级报告标准：荧光染色抗酸杆菌阴性（-）：0条/50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌数）：1～9条/50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）：10～99条/1视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：100条及以上/1视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/1视野；荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：10～49条/50视野。报告2+至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少观察20个视野。

表1. 集菌涂片抗酸染色法法及金胺“O”荧光染色法三维卡方检验

1.4 统计学分析

按照萋-尼氏抗酸杆菌染色和荧光染色镜检结果分级标准，比较两种方法检出的阳性例数，对比萋-尼氏抗酸染色法以及金胺“O”荧光染色检查的假阳性率、假阴性率、灵敏度、特异性、准确度，并计算一致性系数。采用SPSS20.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以（n，%）表示并予以χ2检验，及χ2分割检验（P＜0.05时具有统计学差异）进行两两比较，对两种方法的诊断结果进行比较（配对卡方检验之三维配对卡方检验），P＜0.05则视为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 对比两种染色方法检测结果

金胺“O”荧光染色后，分枝杆菌在荧光显微镜下发出橘黄颜色，高倍镜（物镜40倍目镜10倍）下，能够看到分枝杆菌出现黄绿色荧光，呈现出分枝状或者杆状。抗酸染色后，在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色，见图1。212例标本检测结果表明，直接涂片抗酸染色法阳性率（9.43%，20/212）低于集菌涂片抗酸染色法（13.68%，29/212），直接涂片金胺“O”荧光染色法阳性率（17.45%，37/212）低于集菌涂片金胺“O”荧光染色法（36.32%，77/212），差异具有统计学意义（χ2=6.62，12.37，P=0.02，0.00），见表1。集菌涂片抗酸染色法阳性率（13.68%，29/212）低于集菌涂片金胺“O”荧光染色法（36.32%，77/212），差异具有统计学意义（χ2=13.65，P=0.00）。2.2集菌涂片金胺“O”荧光染色、集菌涂片抗酸染色法检查的诊断效能

金胺“O”荧光染色法的敏感度，特异性，约登指数及似然比值均优于抗酸染色法，差异显著（P＜0.05），即金胺“O”荧光染色较之于抗酸染色法，优势较大，见表1。

3.讨论

对痰标本进行集菌处理被视为一个相对省时又低成本的路径，能够有效的强化痰涂片抗酸杆菌镜检的灵敏度[5]，本研究对沉渣涂片萋-尼染色两种方法、直接涂片萋-尼染色、沉渣涂片萋-尼染色和沉渣涂片金铵“O”染色两类路径展开彼此的对比，结果显示集菌涂片法可提高痰标本抗酸杆菌镜检的阳性率；把离心集菌涂片法与金铵“O”荧光染色法有机结合，很大程度上进一步强化肺结核痰涂片显微镜检查手段的敏感性，同时大幅度强化工作者的舒适感。通过金胺“O”荧光离心集菌染色法检测痰中的结核杆菌操作简单、灵敏度及特异新高，与抗酸染色法对比，能够显著提高低含菌量标本的检出率。