HER4及CD44在黑色素瘤患者中的表达及临床意义

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(福州总医院肿瘤放射治疗中心，福建 福州 350025)

黑色素瘤通常起源于上皮基底层黑色素细胞的恶性肿瘤，其恶性程度较高，极易发生淋巴或血液转移，因此预后通常较差，是危害性较为严重的恶性肿瘤之一[1-4]。人体表皮生长因子4(Human epidermal growth factor 4, HER4)是一种跨膜受体蛋白，在与配体结合后通过自身磷酸化参与细胞的信号传递，信号在细胞内通过激酶级联传递以调节细胞生长及分裂。有多项研究证实，在肿瘤组织中HER4存在过度表达，并且与多种肿瘤疾病的预后有着较为密切关联[5-8]。群集分化44(cluster of differentiation 44，CD44)属于糖基化的细胞表面黏附分子家族，作为一种跨膜受体蛋白广泛表达与上皮细胞及间质细胞。近年来有多项研究相继确认CD44可作为多种恶性肿瘤的干细胞标志物[9-11]。本次研究目的在于探讨黑色素瘤组织中HER4、CD44的表达情况及其与黑色素瘤患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料对2006年1月至2017年12月于本院经病理确诊并收治的共93例黑色素瘤患者采集肿瘤组织标本，在这些患者中有59例男性以及34名女性。年龄范围在30岁～84岁之间，中位年龄56岁。所有病人依据AJCC8版TNM分期[12]，其中I期23例、II期32例、III期28例及IV期10例。在2006～2017年的持续随访过程中共死亡84例，存活9例。

1.2研究方法

1.2.1 免疫组化染色 采用3um厚石蜡切片按照使用说明书进行染色。首先应用热诱导抗原表位修复法修复抗原，采用10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6)蒸汽熏蒸玻片30分钟。随后加入1∶400稀释并在4℃的温度条件下孵育过夜的抗CD44抗体及1:300稀释并在4℃的温度条件下孵育过夜的抗HER4抗体。然后加入37℃孵育的EnVision第二抗体并用3-3′二氨基联苯胺显色，随后应用苏木紫及伊红复染。

染色切片的读片工作由两名具有10年以上病理科工作经验的执业医师对比未使用原抗体的阴性对照进行，并独立评估阳性肿瘤细胞的相对数量(范围:0～100%)和染色强度(范围:0～3分: 0分=无染色，1分=弱染色，2分=中度染色，3分=强染色)。本次试验所用抗CD44抗体由赛默飞公司生产(克隆号：PC100)；抗HER4抗体由Gene公司生产(克隆号：EP2880Y)；EnVision第二抗体由Dako公司生产。

1.2.2 统计学处理 所有数据均采用SPSS19.0进行统计分析。采用χ2检验分析分类资料组间差异，定量资料则根据数据分布特征采用参数或非参的方法分析组间差异。用简单kappa系数描述HER4及CD44表达的相关性。进一步采用Log-Rank检验比较不同亚组患者生存时间的差异并绘制K-M生存曲线。应用COX模型探索CD44及HER4表达对患者预后的影响。检验水准α取值为0.05,当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1性别、年龄与HER4及CD44表达关系93人黑色素瘤组织中HER4表达阳性人数为73人，比例为78.49%；CD44表达阳性人数为65人，比例为68.89%。从图1中可以看出HER4染色主要在细胞质而CD44染色主要在细胞膜。从表1中可以看出，HER4及CD44的表达在不同性别、不同年龄及不同TNM分期等基线特征间差异没有统计学意义(P>0.05)，可见HER4及CD44的表达与年龄、性别及TNM分期间不存在相关性。

图1 HER4及CD44在黑色素瘤组织中的表达情况(400×)A：未经PE染色；B：PE染色；C：HER4表达集中在细胞质；D：CD44表达集中在细胞膜

nHER4阳性阴性χ2 PCD44阳性阴性χ2P总数9373(78.49)20(21.51)65(68.89)28(31.11)性别 男5948(81.36)11(18.64)0.78270.376344(74.58)15(25.42)1.68250.1946 女3425(73.53)9(26.47)21(61.76)13(38.24)年龄 ≤605542(76.36)13(23.64)0.36210.547338(69.09)17(30.91)0.04110.8393 >603831(81.58)7(18.42)27(71.05)11(28.95)分期 I期2319(82.61)14(17.39)2.03560.153616(84.21)7(15.79)0.08590.7695 II期3226(81.25)6(18.75)24(75.00)8(25.00) III期2821(75.00)7(25.00)19(67.86)9(32.14) IV期107(70.00)3(30.00)6(60.00)4(40.00)

2.2 HER4表达与CD44表达间的关系从表2中可以看出，93个患者中同时存在HER4表达阳性及CD44表达阳性的研究对象共有58人占全部研究对象的62.37%；有HER4表达而没有CD44表达的研究对象共有7人，占全部研究对象的7.53%；有CD44表达而没有HER4表达的研究对象共有15人，共占全部研究对象的16.13%；既无HER4表达也无CD44表达的研究对象共13人，占全部研究对象的13.98%。McNemar检验结果显示CD44表达与HER4有较强的相关关系(简单Kappa系数=0.4094,P<0.05)。

表2 HER4表达与CD44表达关系(例，%)

2.3 HER4表达及CD44表达对患者生存时间的影响HER4表达阳性患者中位生存时间为15.65个月，其三年存活率为9.78%；HER4表达阴性患者中位生存时间为46.62个月，其三年存活率为58.06%；Log-Rank检验结果提示HER4表达阳性患者与HER4表达阴性患者生存时间的差异有统计学意义(P<0.01)。CD44表达阳性患者中位生存时间为21.63个月，其三年存活率为29.03%；CD44表达阴性患者中位生存时间为24.37个月，其三年存活率为33.33%；Log-Rank检验结果提示CD44表达阳性患者与CD44表达阴性患者生存时间的差异没有统计学意义(P>0.05)。不同HER4及CD44表达情况患者生存曲线如图2所示。

图2 不同HER4及CD44表达情况患者K-M生存曲线A为CD44表达阳性患者及CD44表达阴性患者的K-M生存曲线，Log-Rank检验提示两组患者生存时间的差异没有统计学意义(P=0.5147)；B为HER4表达阳性患者及HER4表达阴性患者的K-M生存曲线，Log-Rank检验提示两组患者生存时间的差异有统计学意义(P<0.0001)

应用COX模型对不同HER4及CD44表达情况患者进行影响因素分析，结果如表3所示，可以看出HER4阳性表达是影响患者愈后的危险因素，其风险比为4.12(P<0.01)。CD44阳性表达的风险比为1.63(P=0.1041)，虽然统计学角度无法确定其为患者预后的危险因素，但结合K-M曲线不难看出CD44阳性表达对患者预后有一定提示作用。

表3 HER4表达及CD44表达对患者生存时间的影响

3 讨 论

正常情况下HER4的表达多见于骨骼肌、平滑肌细胞、脑组织、肺、胃黏膜等组织中，并且呈低水平或阴性表达。而在恶性肿瘤中HER4表达明显高于正常组织及良性肿瘤组织[13]。HER4的过度表达可能与细胞的凋亡、浸润及远端转移密切相关[5, 14]。本研究结果发现，93例患者中HER4的表达阳性率高达78.49%。在排除了性别、年龄与HER4表达可能存在的相关性的情况下，HER4表达可能与黑色素瘤的发生有密切的关联。有研究认为在一些肿瘤中HER4存在过度表达并且对肿瘤进展有促进的作用，进而缩短患者的生存期[15]，本研究得到了相似的结论，HER4在黑色素瘤组织表达增高，并主要分布在细胞质。

CD44是一种单链跨膜糖蛋白，作为细胞表面黏着分子广泛分布于细胞膜。介导多种生理及病理进程，特别是恶性肿瘤细胞浸润及转移，常与CD44分子密切相关[9]。有研究提示CD44可以作为癌症病人的预后因子来评价患者预后。本次研究将CD44的表达作为疾病预后的指标并未发现其有统计学意义(P>0.05)，该结果是否与样本量有关还需进一步研究。但HER4高表达的恶性黑色素瘤患者的生存率下降。

综上所述，HER4过度表达在黑色素瘤的发生、发展中起着重要的作用并且与患者预后有密切的关系。这提示可以通过干预减少HER4的过度表达可能成为延缓或控制黑色素瘤病程发展的可行方法。