GC—MS/MS测定叠鞘石斛中乐果等三种农药残留的一测多评研究

唐志康 陈文秋 余敏灵

摘要：以叠鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）为研究对象，样品采用乙腈提取，经Cleanert TPH专用净化柱净化。用GC-MS/MS测定样品，根据色谱相对保留时间和质荷比信息对样品进行定性分析，以乐果二级离子扫描峰（125.0/79.0）面积为参照峰，建立以乐果为对照品，测定叠鞘石斛中乐果等三种农药残留量的GC-MS/MS方法。结果表明，乐果、敌敌畏、毒死蜱进样量在0.1～1.0 ng与它们的色谱峰面积有较好的线性关系，最低检出限（以进样量计）分别为1.399×10-2、2.279×10-4、1.757×10-4 ng；平均回收率分别为95.4%、95.0%、94.7%。该一测多评方法简单快速，定量准确，适用于叠鞘石斛中乐果、敌敌畏、毒死蜱农药残留的同时测定。

关键词：GC-MS/MS；叠鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）；乐果；敌敌畏；毒死蜱

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）17-0088-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.023 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： To establish a quantitative method for the simultaneous measurement of the residual level of three pesticides in Dendrobium aurantiacum by GC-MS/MS. The samples were extracted by acetonitrile and purify by Cleanert TPH column. The samples were then tested by GC-MS/MS. Information on relative retention time and mass charge ratio was used for qualitative analysis. The peak area obtained by secondary ion MS of dimethoate（125.0/79.0） was used as the reference peak to establish a method using dimethoate as the reference substance to determinate there sidual quantity of three pesticides in Dendrobium aurantiacum by GC-MS/MS. When the injection quantity of the sample containing dimethoatea， dichlorvos and chlorpyrifosis in the range of 0.1～1.0 ng， there is a good linear relationship between the injection quantity and peak area. Limit of quantification（LOQ） of dimethoate， dichlorvos and chlorpyrifos are 1.399×10-2、2.279×10-4、1.757×10-4 ng； The average recovery rates of dimethoate， dichlorvos and chlorpyrifos are 95.4%， 95.0% and 94.7%. the method is simple， accurate， rapid and is appropriate for the quantification of residual quantity of dimethoate，dichlorvos and chlorpyrifos in Dendrobium aurantiacum.

Key words： GC-MS/MS； Dendrobium aurantiacum； dimethoate； dichlorvos； chlorpyrifos

中药材种植及中药饮片加工储存过程中农药的不当使用，均会影响中药材中药饮片质量，严重危害人体健康[1]。《中国药典》2015年版四部收载了多种农药残留的气相色谱检查方法[2]。近年来，对农药残留量研究报道的文献大多以气相色谱、液相色谱或以其与质谱的联用为主[3-8]。应用GC-MS/MS，根据色谱保留时间和质荷比信息对样品进行定性分析，以樂果二级离子扫描色谱峰（125.0/79.0）面积为参照，建立GC-MS/MS测定叠鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）中乐果等3种农药残留一测多评方法[9]，取得了满意的结果，现将试验结果报道如下，以期为GC-MS/MS测定中药材农药残留量提供一测多评[10-13]研究思路。

1 材料与仪器

1.1 材料

乐果、敌敌畏、毒死蜱标准品溶液（规格：100 μg/mL，乐果、敌敌畏、毒死蜱批号分别为GSB05-2286-2016、GSB05-2298-2016、GSB05-1849-2016，农业部环境监测保护研究所）。乙腈、丙酮为色谱纯，氯化钠、无水硫酸钠为优级纯。叠鞘石斛样品分别采于四川省夹江县歇马乡、麻柳乡、华头镇，按四川省中药材标准（2010年版）鉴定[9]，并按该标准炮制规范制成3个批号样品（歇马乡样品为20161209-1，麻柳乡样品为20161209-2，华头镇样品为20161209-3）。

1.2 仪器

GCMS-TQ8030气质联用仪（岛津中国科技有限公司）；Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱，工作站为LabSolutions GCMS Solutions版本4.20（岛津中国科技有限公司）；Cleanert TPH净化柱（天津博纳艾洁尔公司）。

1.3 方法

以乐果为对照品测定样品中乐果、敌敌畏、毒死蜱的原理是利用样品色谱图中乐果色谱峰和敌敌畏色谱峰、毒死蜱色谱峰相对保留时间进行定位[2]；二级离子碎片图谱中乐果在47.0、62.0、79.0有碎片离子峰（丰度比为155∶13∶100，以79为参比），敌敌畏二级离子碎片图谱中在63.0、93.0、109.0有碎片离子峰（丰度比为24∶100∶25，以93为参比），毒死蜱二级离子碎片图谱中在19.9、257.9、285.9有碎片离子峰（丰度比为24∶100∶49，以258为参比）；通过定位和二级离子碎片图谱碎片离子峰以及其丰度比对乐果、敌敌畏、毒死蜱色谱峰进行定性分析。在定量分析时，精密量取乐果、敌敌畏、毒死蜱标准品溶液各适量，配制成不同浓度的混合溶液，按设定条件进样，记录色谱图，绘制乐果、敌敌畏、毒死蜱进样量对其峰面积的回归曲线，以乐果回归曲线斜率与敌敌畏、毒死蜱回归曲线斜率的比计算校正因子（fs/k=Ks/Kk），通过乐果回归曲线计算乐果含量，通过校正因子及乐果回归曲线计算敌敌畏、毒死蜱含量。

1.3.1 标准储备溶液的制备 精密量取乐果、敌敌畏、毒死蜱标准溶液各1 mL于10 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为标准储备溶液（每1 mL含乐果、敌敌畏、毒死蜱各10 μg）。

1.3.2 样品溶液和空白溶液的制备 取叠鞘石斛（20161209-1）约50 g，粉碎，过3号筛，精密称取细粉1.062 1 g于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r/min匀浆提取1 min，加入2 g氯化钠，再匀浆提取1 min，4 200 r/min离心5 min，取上清液于150 mL鸡心瓶中，再于离心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重复匀浆提取一次，合并提取液，于40 ℃水浴旋转蒸发至约1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入约2 cm高无水硫酸钠，用10 mL正己烷-丙酮（6∶4）预洗后，将样品浓缩液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮（6∶4）洗脱，收集洗脱液于40 ℃水浴旋转浓缩至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm滤膜过滤即得；除称取样品粉末外，按上述操作制备空白溶液。

1.3.3 样品加标溶液的制备 精密称取“1.3.2”叠鞘石斛粉末1.021 3 g，按“1.3.2”样品溶液的制备方法，从“置50 mL离心管中起到收集洗脱液于40 ℃水浴旋转浓缩至近干”，转移至1 mL量瓶中，加标准储备溶液5 μL，用丙酮稀释至刻度，摇匀，0.2 μm滤膜过滤即得。

1.3.4 气相条件 采用Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱，进样口温度250 ℃；线速度47.2 cm/s；程序升温：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min速率升至125 ℃，再以10 ℃/min速率升至300 ℃，保持15 min。进样体积1 μL。载气：高纯氦气（>99.999%）。

1.3.5 质谱条件 离子源温度200 ℃；接口温度250 ℃；溶剂延迟时间5 min；碰撞气为氩气（纯度大于99.999%）；电离方式见表1。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系考察 精密量取标准储备溶液50、100、200、250、300、400、500 μL分置于7个5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。以乐果、敌敌畏、毒死蜱二级离子扫描峰面积分别与对应的乐果、敌敌畏、毒死蜱进样量进行线性回归。

1.4.2 精密度试验 精密量取标准储备溶液0.2～5.0 mL于量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀进行测定，重复进样6次测定精密度。

1.4.3 重复性试验 精密量取标准储备溶液200 μL，分别置6个5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。分别进样测定重复性。

1.4.4 样品溶液稳定性考察 取样品加标溶液分别在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h进样，测定样品稳定性。

1.4.5 最低检出限 取样品加标溶液，按测定条件测得乐果、敌敌畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分别为10.72、658.14、853.77，以S/N的3倍计算最低检出限、10倍计算最低定量限。

1.4.6 回收率试验 取“1.3.2”方法的粉末9份，每份约1 g，精密称定，分置9个50 mL离心管中，分为3组，每组3份，第1组中每份加标准储备溶液40 μL，第2组中每份加标准储备溶液50 μL，第3组中每份加标准储备溶液60 μL。取样品溶液按测定条件分别进样，记录图谱；另取乐果对照品溶液用丙酮稀释至含乐果0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μg/mL的溶液，按测定条件分别进样，记录色谱图，计算乐果二级离子扫描峰面积和进样量间的回归方程得：A=615 047m-100.3（n=5，r=0.999 6），按回归方程A=615 047m-102.4计算供试品中乐果含量；按校正方程A敌敌畏=615 047mf敌敌畏/乐果-102.4计算敌敌畏含量，按校正方程A毒死蜱=615 047mf毒死蜱/樂果-102.4计算毒死蜱含量。

2 结果与分析

2.1 图谱解析

精密量取标准储备溶液250 μL于5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。在“1.3.4”“1.3.5”条件下测定，取对照品溶液、样品溶液、样品加标溶液、空白溶液分别进样，记录色谱图，在对照品溶液二级离子扫描色谱谱图中有乐果二级离子扫描（125/79）、敌敌畏二级离子扫描（185/93）和毒死蜱二级离子扫（313.9/257.9）色谱峰，保留时间分别为10.663、5.690、13.191 min，在空白溶液色谱图和样品溶液色谱图中没有上述色谱峰，在样品加标溶液色谱图中有和对照品溶液色谱图中保留时间一致的乐果、敌敌畏、和毒死蜱二级离子扫描色谱峰，如图1；对照品溶液和样品加标溶液的二级离子碎片图谱中乐果在47、62、79处（丰度比为155∶13∶100，以79为参比），敌敌畏在63、93、109处（丰度比为24∶100∶25，以93为参比），毒死蜱在194、258、286处（丰度比为24∶100∶49，以258为参比），均有二级离子碎片峰，如图2。

2.2 线性关系考察

以乐果二级离子扫描（125.0/79.0）峰面积A1与乐果进样量m1（ng）进行线性回归，得回归方程：A1=615 311m1-173，r1=0.999 8（n=7），乐果进样量在0.1～1.0 ng与乐果二级离子扫描峰（125.0/79.0）面积有较好的线性关系；以敌敌畏二级离子扫描峰（185.0/93.0）面积A2与敌敌畏进样量m2（ng）进行线性回归，得回归方程：A2=2 016 535m2-203，r2=0.999 7（n=7），敌敌畏进样量在0.1～1.0 ng与敌敌畏二级离子扫描峰（18.05/93.0）面积A2有较好的线性关系；以毒死蜱二级离子扫描峰（313.9/257.9）面积A3与毒死蜱进样量m3进行线性回归，得回归方程：A3=1 278 304

m3-68，r3=0.999 3（n=7），毒死蜱进样量在0.1～1.0 ng与毒死蜱二级离子扫描峰（313.9/257.9）面积有较好的线性关系。

2.3 f值和t值的计算与耐受性考察

2.3.1 f值和t值的计算 敌敌畏色谱峰峰面积和乐果色谱峰峰面积的校正因子f敌敌畏/乐果=3.277 3，相对保留时间t敌敌畏/乐果=0.533 6；毒死蜱色谱峰峰面积和乐果色谱峰峰面积的校正因子f毒死蜱/乐果=2.077 5，相对保留时间t毒死蜱/乐果=1.237 1。

2.3.2 f值的耐受性考察 实际应用中，色谱条件可能会有一些变化，因此对线速度、进样量可能影响f值的因素进行考察，结果表明，f值的波动不大（表2）。

2.4 精密度试验

重复进样6次，测得乐果二级离子扫描色谱峰（125.0/79）平均峰面积为245 997，RSD为0.3%；敌敌畏二级离子扫描色谱峰（185.0/93.0）平均峰面积806 875，RSD为0.7%；毒死蜱二级离子扫描色谱峰（313.9/257.9）平均峰面积511 892，RSD为0.5%，精密度较好。

2.5 重复性试验

试验测得乐果二级离子扫描色谱峰（125.0/79.0）平均峰面积为246 081，RSD为0.5%；敌敌畏二级离子扫描色谱峰（185.0/93.0）平均峰面积806 593，RSD为0.6%；毒死蜱二级离子扫描色谱峰（313.9/257.9）平均峰面积511 427，RSD为0.4%，表明试验重复性好。

2.6 样品溶液稳定性

取样品加标溶液，分别在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h进样，结果表明，乐果二级离子扫描色谱峰（125.0/79.0）面积、敌敌畏二级离子扫描色谱峰（185.0/93.0）面积、毒死蜱二级离子扫描色谱峰（313.9/257.9）面积变化不大，RSD分别为0.9%、0.8%、0.6%，表明稳定性良好。

2.7 最低检出限

取样品加标溶液，按测定条件测得乐果、敌敌畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分别为10.72、658.14、853.77，以S/N的3倍计算最低检出限、10倍计算最低定量限。结果测得乐果、敌敌畏、毒死蜱最低检出限（以进样量计）分别为1.39×10-2、2.27×10-4、1.75×10-4 ng；最低定量限（以进样量计）分别为4.66×10-2、7.59×10-4、5.856×10-4 ng。

2.8 回收率试验

试验计算出乐果二级离子扫描峰面积和进样量间的回归方程得：A=615 047m-100.3（n=5，r=0.999 6），按回归方程A=615 047m-102.4计算供试品中乐果含量；按校正方程A敌敌畏=615 047mf敌敌畏/乐果-102.4计算敌敌畏含量，按校正方程A毒死蜱=615 047mf毒死蜱/乐果

-102.4计算毒死蜱含量结果，乐果平均回收率为95.4%，RSD为1.5%（表3）；敌敌畏平均回收率为95.0%，RSD为1.1%（表4）；毒死蜱平均回收率为94.7%，RSD为0.9%（表5）。

2.9 样品测定

分别取3个批号叠鞘石斛（批号为20161209-1、20161209-2、20161209-3）约50 g，粉碎成末过3号筛，分别精密称定粉末约1 g，制备样品溶液，取样品溶液按测定条件分别进样，记录图谱，测得样品中乐果、敌敌畏、毒死蜱残留量见表6。

3 讨论

当色谱条件有细微改变时，相对保留时间有细微变化，但在该试验中，被测定物质的定性主要采用二级离子碎片峰及其丰度比确认，所以对相对保留时间的耐受性没有进行考察。

仪器建议进样体积不超过1 μL，在相对校正因子f值耐受性考察时，对进样体积0.9、1.0、1.1 μL时的f进行了比较，结果变化不大。

对多种药材农药残留的含量测定进行了研究，发现由于中药材含有多种成分，某些成分对测定会有一些干扰，所以在测定具体某一品种时应设计具体的试验参数，并进行相应方法学论证。

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