兔精液保存的研究进展

王重重 彭辉

摘要：人工授精技术的应用极大促进了现代畜牧业的发展，而精液保存是制约人工授精技术广泛应用的重要一环。虽然对兔精液保存的研究较早，但是进展仍然缓慢。作者主要对兔精液的保存原理、保存方法以及影响兔精液保存的相关因素进行了综述，以期为探究出更好的兔精液保存方法以及人工授精技术在商品兔生产中的广泛应用提供参考。

关键词：兔精液；保存方法；保存原理；影响因素

中图分类号：S858.291 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）16-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.001 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress on Rabbit Semen Preservation

WANG Chong-chong，PENG Hui

（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

Abstract： The application of artificial insemination tremendously accelerates the development of modern animal husbandry，while semen preservation is an important part restricting the extensive application of artificial insemination technology. Although the study of rabbit semen preservation has been carried out early， the progress is still slow. The authors mainly reviewed the preservation methods， preservation principles and related factors affecting the semen preservation of rabbit semen， in order to provide a reference for exploring better rabbit semen preservation methods and the application of artificial insemination technology in the production of commercial rabbits.

Key words： rabbit semen； preservative methods； preservative principles； influencing factors

目前，中国养兔产业的规模不断扩大，培育高品质和高繁殖率的种公兔群对于兔产业的发展至关重要。伴随着兔产业的快速发展，人工授精技术在商品兔生产中越来越重要[1]。虽然人工授精技术在家畜繁殖上的应用比较成熟，但是在兔生产中的应用还存在一定的問题，其中兔精液保存就是影响兔生产人工授精技术推广的一个非常重要的因素[2，3]。兔精液的保存主要分为常温保存、低温保存和冷冻保存三个方面。精液常温保存时，由于精子自身的新陈代谢旺盛，能量消耗快，只能保存较短的时间。兔精液在低温状态下可以保存一周左右，因此，对于优良的种公兔精液若想长期保存或者跨季保存，低温保存则无法完成。冷冻保存可以使精液长期或者跨季节保存，但是对精子的损伤也较大，精液解冻后，精子活率较低，并且冷冻保存也需要较高的投入[4]。因此，精液冷冻保存技术在兔生产中的应用相对受限。为此，研究人员对该技术的研究在不断深入，以期实现精液冷冻保存技术在兔生产中的应用[5]。本研究主要对兔精液的保存方法、保存原理以及影响兔精液保存的相关因素进行综述，以期为探究出更好的兔精液保存方法以及人工授精技术在商品兔生产中的广泛应用提供参考。

1 兔精液的保存原理与方法

1.1 兔精液保存原理

精液常温保存的原理：精液稀释液中加入一些酸性物质或充入CO2，进而控制精液的pH，使精子处在酸性环境中。精子在酸性环境下的活动受到抑制、能量消耗降低，其处于可逆的静止状态，且可保持受精能力。

精液低温保存的原理：在低温环境下精子处于休眠状态，其代谢机能和运动能力都大大减弱。在此条件下精子所消耗的能量减少，仍然保持着受精能力，升温后便可恢复。

精液冷冻保存的原理：在超低温条件下，精子代谢机能几乎停止，运动也停止，其活性以相对静止的方式保留下来。当温度回升后，精子代谢机能、运动能力以及受精能力又会恢复起来[6，7]。

人工采集的精液并不能在自然条件下长期保存，需要经过进一步的处理才能延长保存时间。在商品兔生产中，可以根据实际需求选择使用不同的保存方法。

1.2 兔精液的液态保存

兔精液的液态保存可分为常温保存和低温保存。常温条件下保存时，一般是将精液稀释后分装并密封，用纱布包好在15～20 ℃的环境下避光保存，其保存时间不长，一般保存1～2 d。低温保存时，保存温度一般是0～5 ℃，精液稀释后通过缓慢降温的方法将温度降到0～5 ℃，并用纱布包裹放入低温环境中，可以保存一个星期左右[8]。

兔精液的液态保存方法具体如下：将采集的精液用4层纱布过滤，为消除种兔间个体差异，将目测品质正常的精液进行混合，然后利用显微镜进行精子活力和密度的检测。检测完成后，使用商业化的兔精液稀释液或者使用自行配制的稀释液，并在30 ℃左右温度下平衡30～60 min后待用。精液稀释时，将精液与稀释液置于同一温度下，以1∶50～1∶15的比例稀释精液。精液稀释完成后还需要再次检测精子活力，要求镜检精子活力在0.6以上[9，10]，之后将符合要求的兔精液进行分装保存。兔精液低温保存时，还需要在稀释液中加入卵黄或奶类等抗冻物质，以防止精子发生冷休克。

1.3 兔精液的冷冻保存

兔精液的冷冻保存即超低温保存，是将采集的兔新鲜精液进行特殊处理，使用干冰（-79 ℃）或液氮（-196 ℃）等作为冷冻源，将精液保存在超低温的环境下，进而达到长期保存的目的[6]。兔精液冷冻保存的具体操作如下。

1.3.1 精液稀释以及降温平衡 目前，在精液稀释时多采用两步稀释法，即在降温平衡之后再加入渗透性冷冻保护剂，避免冷冻对精液产生较大的毒害作用。由于冷冻保护剂加入不久就要进行下一步冷冻，因此，两步稀释法会增加操作难度。此外，冷冻保护剂的保护效果可能会因保护剂未完全渗透而下降，需要对渗透性冷冻保护剂进行提前降温，注意此过程操作要迅速，避免精子在第二次的稀释过程中死亡[4]。兔精液采集后尽量在短时间内完成相关操作，在鲜精经过品质检查后，把活率高于0.8的用于冷冻保存[11]。操作上将精液加入到离心管中，将配好的稀释液从水浴锅（37 ℃）中取出，按一定稀释比例将稀释液加入到离心管中，混合均匀后用封口膜封口并编号，然后用纱布包裹若干层[4]。精液在冷冻保存之前需要进行降温平衡处理，即将精液稀释后经缓慢降温至4～5 ℃，并在该温度下放置一段时间，使精子的耐冻性得以增强，这个处理过程叫做降温平衡[4]；一般将兔稀释精液在2 h内逐渐冷却至4 ℃，并在此温度下平衡30 min左右[12]。

1.3.2 熏蒸和冷冻 熏蒸是指精液在放入液氮罐中冷冻保存之前先用液氮气体进行熏蒸，其目的是保证精液以玻璃态进行冷冻，减少精子因冰晶化而导致的死亡。首先取一密闭可开口的容器（如泡沫箱），检测其密闭性并确认其不漏液，将液氮从液氮罐中倒入泡沫箱。之后将平衡后的精液从4 ℃恒温箱中取出，充分摇匀，放在纱布上；用细管吸取相对应离心管中的精液，并用烧热的镊子在恒温箱中进行细管封口。若无恒温操作箱，细管封口过程可在垫3～4层纱布的冰上操作[4]。封管过程要迅速，以减小或避免温度回升造成的精子死亡。封管后将细管放在液氮上方熏蒸10 min，熏蒸结束后，将细管分装在纱布袋中并投入液氮里，之后转移至液氮罐中冷冻保存。精液解冻时，可将液氮罐中的细管取出，迅速投入37 ℃水浴锅中解冻30 s，待细管颜色变黄后取出则可[13]。

2 影响兔精液保存的因素

2.1 影響精液液态保存的因素

2.1.1 pH 在液态精液的保存过程中，由于精子代谢机能仍然存在，尤其在常温保存的条件下代谢很强，且能量消耗较快，伴随着代谢产物的积累，精液的pH也会发生变化[1]。由于pH的变化致使一些酶活性受到抑制，进而影响精子的受精能力。因此，保持精子所处环境的pH在一定范围是必要的。一般正常精液的pH在6.59～7.50，精液液态保存时要与正常精液的pH相等或偏低方可[10]。

2.1.2 温度 精液液态保存时，其基本条件就是依据精液相应的生理特性，提供精子在体外生存的适宜环境，而精子的保存温度是影响精子能否存活的重要环境因素[10]。低温保存在一定程度上使精子代谢变慢，能量消耗减少，可延长精子的体外存活时间，并使其受精能力得到维持。兔精液采集后，如果快速从体温下降到0 ℃会导致精子大量死亡，因为温度剧烈变化致使精子细胞膜中相关的脂类发生变化，导致膜流动性下降，进而阻碍蛋白质的运动和组装，最终导致精子膜的选择通透性丧失，膜上酶的活性下降，膜通道调节失控，所以应根据精液液态保存方法选择合适的降温速度对精液进行降温并保存[14]。

2.1.3 稀释液成分 兔精液液态保存的稀释液可以在一定程度上使精子的代谢降低，体外存活时间延长且提高精液的利用率。对于稀释液来说，营养剂和保护剂是其主要组成部分。营养剂主要有葡萄糖、蔗糖、卵黄和奶类等，可以提供精子在体外生存所需的养分，并为精子补充能量。此外，加入的糖类可以和细胞膜上的磷脂作用起到保护精子膜的作用[15，16]。卵黄和奶类还可以调节稀释液的渗透压，使精液中电解质的浓度降低、防止精子膜被破坏[10，16]。稀释液中的保护剂主要是缓冲物质和其他一些添加物，缓冲物质包括柠檬酸、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠等，这些缓冲物质可以中和精子代谢过程中产生的酸以及使相应的酶反应得到很好的缓冲。另外，在兔精液稀释液中也会加入相应的抗生素如青霉素和链霉素等，主要是抑制病原微生物对精子的危害。研究表明，维生素C和维生素E对精子有一定的保护作用[17]，在兔精液稀释液中加入一定量的维生素C后可以提高兔精子的活力、存活时间和生存指数[9]；还有研究表明，加入牛磺酸对兔精液的保存也具有良好的效果[18]。

2.1.4 稀释液渗透压 稀释液的渗透压对精子活力的影响是至关重要的，兔精液稀释保存时渗透压不能过高也不能过低，一般有利于保护精子相应功能的介质应是等渗或稍高渗[10]；非离子物质如葡萄糖等主要参与稀释液渗透压的维持。此外，稀释液的离子强度在精子的体外保存过程中可能不起主要的作用，但精子表面蛋白溶解脱落而导致的精子损伤却是离子强度过高造成的。

2.2 影响兔精液冷冻保存的因素

2.2.1 冷冻保存稀释液 兔精液在冷冻保存之前需要进行一定的稀释，精液冷冻保存的效果会因稀释液成分的不同以及同一稀释液所稀释的比例不一样而发生变化。目前，以Tris、葡萄糖和柠檬酸作为主要成分配制的稀释液最符合兔精液特性，但精液保存效果也受到这些稀释液浓度的影响[19，20]。

2.2.2 冷冻保护剂 精子的冷冻过程会对精子产生损伤，通过在稀释液中添加冷冻保护剂则可以使精子所受到的损伤降低。目前，常用甘油、乙二醇和DMSO等渗透性抗冻保护剂来降低冷冻过程中冰晶化对精子造成的损伤。此外，还会添加一些对精子膜稳定性起到保护作用的物质，如添加一定量的海藻糖可以显著改善兔精子的运动性、顶体完整性、质膜完整性和线粒体活性等[13]。稀释液中加入一定量的蔗糖等大分子聚合物可以提高其粘度，在冷冻过程中可以更好地保护精子[15，16]。另外，加入一定量的甘氨酸也可以在精子的冷冻保存中起到很好的保护效果[21]。对于兔精液而言，其冷冻保护效果会因冷冻保护剂的不同而发生明显差异。如果在兔精液的冷冻保存过程中只添加甘油作为冷冻保护剂，那么其所表现出的冷冻保护效果会比使用其他冷冻保护剂的效果差；甘油虽然可以作为多数家畜精液最适的冷冻保护剂，但在兔精液的冷冻保存中并非如此，因为甘油本身会对兔精子产生不良影响[4]。在兔精液的冷冻保存过程中，一般会使用高渗透性的DMSO作为冷冻保护剂，其毒性较甘油小，但是DMSO在一定程度上会破坏精子顶体的完整性，而在稀释液中添加海藻糖等非渗透性保护剂则可以降低顶体所受到的损伤。研究表明，在兔精子冷冻保存过程中，稀释液中加入卵黄也可以对精子起到保护作用[16]。

2.2.3 稀释液渗透压 正常情况下，精子的渗透压与精浆的渗透压保持一致。若冷冻保存所用的稀释液渗透压较精子内部的高，则会导致精子脱水，进而造成精子皱缩；如果精子内的渗透压较稀释液的高，精子便会吸水膨胀，进而发生破裂。因此，精子内的渗透压会随着稀释液渗透压的不同而发生一定的变化，但稀释液的渗透压如果超出精子渗透压的阈值，精子的代谢和活力就会受到严重影响[22]。研究表明，中性或酸性的低渗溶液对家兔精子的影响更大[4]。

2.2.4 平衡和熏蒸时间 精液冷冻保存的效果会因降温和平衡时间的长短而发生一定的变化。一般来说，平衡时间在30～120 min不等，因为冷冻保护剂浓度的高低也会影响平衡时间，因此要根据实际情况来确定合适的平衡时间[23]。同样，熏蒸时间也会对精液冷冻保存效果产生影响，因为冷冻保护剂及其浓度也会影响熏蒸时间，目前，熏蒸时间以10～15 min为宜[4，24]。

2.2.5 抗氧化剂 在精液冷冻过程中，精子必然会受到低温胁迫，进而提高其活性氧水平，因为在平衡过程中，精子暴露在空气里，而空气中的氧浓度较生殖道中的高[25]。此外，精子也会受稀释液中的金属离子影响，其导致精子在冷冻过程中产生更多的活性氧，从而使精子出现氧化应激损伤。因此，在精液的冷冻保存过程中，需要加入一些抗氧化剂来减小精子受到的损伤。抗氧化剂在猪和牛等家畜的精液保存中研究得较为深入，但在兔精液保存方面的研究相对较少。目前在兔子上的一些研究表明，在稀释液中加入一定浓度的半胱氨酸会保护精子不受活性氧的损伤[4，26]。此外，在兔精液冷冻保存液中加入一定量的谷氨酰胺和维生素E也可以保护精子的活力、顶体完整性以及防止精子脂质过氧化，进一步提高兔精液的冷冻保存效果[12，23]。

3 结语

人工授精技术的应用极大促进了现代畜牧业的发展，而精液保存是制约人工授精技术广泛应用的重要一环。如果优良种公畜的精液保存得当，则可以进行长途运输，进而扩大精液的使用范圍，增加受配母畜头数和提高种公畜的配种效率。虽然对兔精液保存的研究较早，但是进展仍然缓慢。目前，在商品兔生产中应用较多的仍是精液现采现用。在生产实践中对兔精液的保存，尤其是低温保存和冷冻保存的研究工作还较少，仍需要进一步对兔精液的低温和超低温保存技术进行探讨。只有揭示出兔精子保存过程中的生理变化以及分子机制，才能优化精液稀释液成分和精液保存体系，进一步建立兔精液的高效保存方法，使优良种公兔遗传资源得到充分利用，进而推动养兔业更好的发展。

参考文献：

[1] 李世维，胡享兵.兔场人工授精存在的问题及建议[J].养殖与饲料，2017（2）：36-37.

[2] 穆秀明，王 净，吴淑琴，等.塞北兔精液常温保存效果的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2013（5）：144-146.

[3] 穆秀明，吴淑琴，王 净，等.不同稀释液对塞北兔精液保存效果的影响[J].黑龙江动物繁殖，2011，19（2）：11-13.

[4] 范楚宁.半胱氨酸对獭兔精液冷冻保存效果的影响[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2015.

[5] 张 楠.维生素E类似物对兔精子耐冻性的影响[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2015.

[6] 陈宠霞，金 一.兔精液液态保存的研究进展[J].中国养兔，2006（3）：27-29.

[7] ZHU Z D，FAN X T， PAN Y，et al. Trehalose improves rabbit sperm quality during cryopreservation[J].Cryobiology，2017，75：45-51.

[8] EMMENS C W，BLACKSHAW A W. The low temperature storage of ram，bull and rabbit spermatozoa[J].Australian Veterinary Journal，1950，26：226-228.

[9] 杨 波，蔡缪荧，张 昊，等.维生素C对新西兰白兔精液常温保存的影响[J].上海畜牧兽医通讯，2014（5）：40-42.

[10] 陈宠霞，金 一.添加牛磺酸对兔精液液态保存质量参数的影响[J].畜牧与兽医，2006，38（8）：22-25.

[11] 杨 博.新西兰兔精子冷冻保存研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2009.

[12] 娄安钢，李继鹏，崔成都.家兔精液冷冻保存的研究[J].延边大学农学学报，2009，31（1）：57-61.

[13] ZHU Z D，FAN X T，LV Y H，et al. Glutamine protects rabbit spermatozoa against oxidative stress viaglutathione synthesis during cryopreservation[J].Reproduction Fertility and Development，2017，29（11）：2183-2194.

[14] 陈 玉，石德顺，崔奎青，等.兔精液冷冻保存的研究[J].黑龙江动物繁殖，2007，15（3）：1-3.

[15] 王 平.导致公兔精液品质不良的因素探析[J].黑龙江畜牧兽医，2000（1）：37-38.

[16] KULIKOVA BARBORA，DI IORIO M，KUBOVICOVA ELENA，et al. The cryoprotective effect of Fic-oll on the rabbit spermatozoa quality[J].Zygote，2015，23（5）：785-794.

[17] IAFFALDANO N，DI IORIO M，ROSATO M P. Cryopreservation of rabbit semen using non-permeable cryoprotectants：Effectiveness of different concentrations of low-density lipoproteins（LDL） from egg yolk versus egg yolk or sucrose[J].Animal Reproduction Science，2014，151（3/4）：220-228.

[18] 楊海涛，贾永红.维生素E和C保护精子的作用研究进展[J].畜牧兽医杂志，2009，28（3）：39-40.

[19] CORTELL C，VIUDES DE CASTRO M P. Effect of gelatin addition to freezing extender on rabbit semen parameters and reproductive performance[C].Proceedings of the 9th World Rabbits Congress，2008.327-332.

[20] ROSATO M P，IAFFALDANO N. Effect of chilling temperature on the long-term survival of rabbit spermatozoa held either in a tris-based or a jellified extender[J].Reproduction in Domestic Animals，2011，46（2）：301-308.

[21] 罗光彬，王宝生 ，贾俊龙，等.甘氨酸及二甲基亚砜对冷冻保存兔精液活率的影响[J].沈阳农业大学学报，2011，42（6）：733-735.

[22] WATSON P F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen[J].Animal Reproduction Science，2000，60：481.

[23] 田秀娥，蔺晓舟.不同平衡时间对獭兔精液冷冻保存效果的影响[J].中国畜牧兽医文摘，2015（2）：145.

[24] ZHU Z D，FAN X T，LV Y H，et al. Vitamin E analogue improves rabbit sperm quality during the process of cryopreservation through Its antioxidative action[J].Plos One，2015， 10.e0145383.

[25] BAUMBER J，BALL B A，GRAVANCE C G，et al. The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility，viability，acrosomal integrity，mitochondrial membrane potential，and membrane lipid peroxidation[J].Journal of Andrology，2000， 21（6）：895-902.

[26] ZHU Z D，Ren Z J，FAN X T，et al. Cysteine protects rabbit spermatozoa against reactive oxygen species-induced damages[J].Plos One，2017，12. e0181110.