禽类卵泡抗苗勒管激素研究现状与展望

潘爱銮 卓桂梅 申杰 蒲跃进 吴艳 皮劲松 孙静 梁振华 张昊 杜金平

摘要：简要介绍了禽类生殖生理与卵泡发育特性，概述了抗苗勒管激素（Anti-Mullerian hormone，AMH）的特点、检测方法，综述了禽类AMH研究进展，提出了AMH在禽类繁殖潜能评估上的应用前景。

关键词：禽类；卵泡；抗苗勒管激素；繁殖潜能

中图分类号：S814.1 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）16-0009-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.002 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The Research Status and Prospect of Anti-Mullerian Hormone in Poultry Follicle

PAN Ai-luan1，ZHUO Gui-mei2，SHEN Jie1，PU Yue-jin1，WU Yan1，PI Jin-song1，

SUN Jing1，LIANG Zheng-hua1，ZHANG Hao1，DU Jin-ping1

（1.Institute of Animal Husbandry and Vetervinary，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Innovation Center of

Agricultural Science and Technology/ Hubei Key Lab of Animal Embryo Technology and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China；

2.Animal Husbandry & Veterinary and Fishery Bureau of Baoting County in Hainan Province，Baoting 572300，Hainan，China）

Abstract： The poultry reproductive physiology and follicular features were briefly introduced； the resistance and test method of anti-Mullerian hormone （AMH） were summarized. And then the AMH research progress of poultry was reviewed. The AMH in poultry breeding potential assessment on the application prospect was put forward.

Key words： poultry； follicular； anti-Mullerian hormone； reproductive potential

抗苗勒管激素（Anti-Mullerian hormone，AMH）又称苗勒管抑制物质（Mullerian inhibitory substance，MIS），因其在哺乳动物雄性胎儿的发育过程中，具有引起苗勒管退化的重要作用而得名。最初对其的研究重点在于对胚胎发育及性别分化的作用，近年来其与卵巢功能的关系逐渐成为研究的热点[1]。AMH是反映人类卵巢健康和预测卵巢储备功能的可靠标志物，在监测卵泡生长状态等方面具有重要的应用价值[2-4]。现在随着AMH在预测人卵巢储备功能方面研究的不断深入，AMH在畜禽中的作用也逐渐受到关注。关于禽类AMH的研究报道虽然不多，但已引起人们的重视。为此，对近年来禽类卵泡AMH的研究进展进行综述，旨在为促进AMH在禽类繁殖中的深入研究和应用提供参考。

1 禽类生殖生理与卵泡发育特性

1.1 禽类生殖生理特性

与哺乳动物相比，禽类在生殖解剖学构造和生理学机能等方面具有其特异性。主要表现在雌禽生殖器官由卵巢和输卵管组成[5]，成年雌禽仅左侧的卵巢和输卵管发育正常，而右侧的卵巢和输卵管在胚胎孵化中后期及个体早期生长过程里就停止发育，并逐渐退化[6]；禽类卵巢外观似一串葡萄，通过系膜韧带悬于腹腔的背壁上，含有不同发育阶段的许多卵泡，是卵生动物；在一定的时间内，卵巢上的卵泡可以连续发育、成熟并排卵，但排卵后没有黄体形成，因而也没有哺乳动物那样的规律发情周期；禽类的卵子较大，雌禽受精卵在体内发育时期所需要的营养物质由输卵管分泌供给，随后以蛋的形式出现；受精蛋在体外保存，在条件适宜时，受精蛋可孵化发育为胚胎，孵化出雏用时短，没有妊娠期，胚胎发育所需营养主要由受精蛋的蛋黄供应，而非依赖于母体供应[7]。

1.2 禽类卵泡的发育特性

禽类卵巢分为皮质部和髓质部，皮质部含有各级卵泡，包括原始卵泡、生长卵泡（包括初级卵泡、次级卵泡）和成熟卵泡[8]；髓质部主要是结缔组织，具有众多的血管、神经和平滑肌[9]。每一个卵泡包含一个卵子及其周围的卵泡细胞，呈球状，卵泡细胞中的颗粒细胞（Granulosa cell，GC）和膜细胞（Theca cell，TC）对卵泡发育以及卵子的成熟、营养物质积累起到至关重要的作用[10]。

在出雏后不久，雌禽卵巢中的卵子开始被体细胞包围，形成原始卵泡；禽类性成熟时，部分原始卵泡经初始募集被激活，并发育为生长卵泡（包含初级卵泡和次级卵泡），根据直径大小可将生长卵泡分为三类，其中小白卵泡（Small white follicle，SWF）直径小于1 mm，大白卵泡（Large white follicle，LWF）直径为2～4 mm，小黄卵泡（Small yellow follicle，SYF）直径5～10 mm，大部分生长卵泡会在发育过程中闭锁[11，12]。在排卵期，每天有一个大体积的SYF被选择并发育成为排卵前卵泡，且从大到小依次排序[13]，卵巢所含有的体积最大的5～6个成熟卵泡伸向腹腔，从大到小依次用F1、F2、F3…表示，被称为等级卵泡，并依次排卵[14，15]。初级卵泡埋在皮质内，位于皮质浅层，体积较小，由毛细血管包围其外，卵母细胞周围仅有一层颗粒细胞及基膜包绕，无卵泡膜；次级卵泡中的颗粒细胞增殖至2～3层，基膜外的结缔组织分化形成卵泡膜；成熟卵泡不是位于卵巢皮质内，而是完全突出于卵巢组织表面，并逐渐被卵巢上皮包围，仅通过结缔组织形成的卵泡柄与卵巢相连[16]。成熟的卵泡内无卵泡腔，也没有卵泡液，只在卵泡膜中分布有大量的毛细血管。即将排卵的卵泡有一条几乎没有血管的灰色破裂线，排卵时，卵子自卵泡膜上的破裂线排出，排卵后，卵泡膜的破裂线很整齐，边缘光滑，没有组织撕裂现象，破裂的卵泡膜很快皱缩成一薄腔空囊附着在卵巢上，约10 d后缩成一遗痕，卵泡结构很快退化，不形成黄体，不具备规律的发情周期，无月经[8]。初生母雏卵巢中大约有48万个卵子，经卵泡选择后，只有数百个卵子能够发育成熟并排卵[17]。在产蛋期，禽类卵巢中总有陆续成熟、大小不等的卵泡存在，成熟卵泡按大小等级排列，逐一排卵[18]。禽类的成熟卵母细胞（俗称卵黄或蛋黃）营养物质丰富，含有约51%的水分、33%的类脂物和16%的蛋白质，是禽类胚胎发育的主要营养源[19]。

2 AMH特点

2.1 AMH的结构

AMH是由两个相同的约70 kD的单体亚基经二硫键连接为糖蛋白的二聚体，是分子量为140 kD的糖蛋白激素[20]。人类AMH基因位于第19号染色体短臂上，长度为2.4～2.8 kb，包含5个外显子，编码560个氨基酸残基蛋白质前体[21]。家鸡祖先红色原鸡的AMH基因位于第28号染色体，长度为4 024 bp，包含5个外显子，AMH蛋白含有644个氨基酸残基[22]。

2.2 AMH的特性

人类医学研究发现，血清AMH水平具有相对变异性与相对稳定性。相对变异性指育龄期女性血清AMH水平随着年龄增长而逐渐下降。女性出生时血清AMH水平最低，幼年期后逐渐升高，青春期后血清AMH水平会进入到平台期，并一直维持到25周岁，25周岁后血清AMH水平与年龄呈负相关，随年龄增长，AMH水平逐渐降低[23]。另外，AMH水平有种族差异，相同年龄段的东南亚黄种女性的AMH值比白种女性低，表明AMH水平与遗传背景有关[24]。相对稳定性是指月经周期内和周期间的AMH水平相对稳定，主要表现为血清AMH水平不受下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴分泌的促性腺激素、外源性促性腺激素类似物、避孕药等的影响[25]，在整个月经周期无明显波动[26]，相对于卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）水平等传统的评价女性卵巢功能的“生殖激素六项”指标而言，AMH在检测者月经周期中保持恒定，血清AMH的水平不会随着性腺激素的波动而变化，表明AMH更能精确地评估卵巢储备能力[27]，这是目前预测卵巢储备功能最好的血清标记物质[25，28]，也是外周血可以检测到的卵泡最早产生的物质[1]。不过有少数的临床研究发现，经期内或经期间的AMH水平会发生小幅波动，但不影响其临床测量意义[29]。

另外，对奶牛的研究表明，血浆AMH浓度可数月保持不变[30]，每头牛的AMH含量存在一个自身的循环特点，AMH测量值的有效期至少1年[31]。

2.3 AMH的功能

AMH在卵泡发育过程中，主要调控卵泡的募集和优势卵泡选择过程，AMH只在性腺产生，在卵巢生长卵泡的颗粒细胞中表达，仅表达于健康卵泡，在闭锁卵泡中不表达[32]，能防止原始卵泡池过早耗尽、维持卵巢储备功能，并保持卵泡募集、生长发育及闭锁的动态平衡[33，34]。

在哺乳动物的胚胎发育过程中，胎儿可生长出两对生殖管道，一对是中肾管（The ghvbmesonephric），也称沃尔夫管（Wolffian ducts），其将分化为雄性生殖器官中的输精管、附睾、精囊；另一对是副中肾管（The paramesonephric），也称苗勒氏管（Mullerian ducts），其将分化为雌性生殖器官的输卵管、子宫、阴道上部。因此，对于正常雄性、雌性个体来说，胎儿中只能有其中一对生殖管继续发育，而另一对则必须退化[35]。1947年，法国科学家Alfred Jost发现，AMH是由睾丸未成熟的支持细胞分泌，具有抑制雄性胚胎苗勒氏管发育、诱导苗勒氏管退化的作用，可促使中肾管演变成雄性生殖系统[36，37]。当缺乏AMH时，苗勒氏管则分化、发育成为子宫、输卵管和阴道上部[38]。

AMH由初级卵泡产生，通过旁分泌抑制原始卵泡进入生长卵泡池，从而调控卵泡的起始募集。对AMH转基因小鼠的观测结果表明，AMH可能抑制原始卵泡的启动，导致生长卵泡减少[39]。女性有腔卵泡中AMH表达量最高；随着卵泡的生长，AMH表达逐渐下降，这有利于对优势卵泡的选择[40]。

2.4 AMH分泌规律

医学研究表明，对于雄性，AMH最早是由5周的胚胎睾丸内的支持细胞合成；而对于雌性，AMH最早是由妊娠36周的胚胎卵巢内的卵泡颗粒细胞合成[41，42]；女性出生时，血清内几乎检测不到AMH[43]；出生后几周血清AMH浓度开始缓慢上升；青春期女性体内的AMH 浓度保持相对的稳定，处于平台期[44]；青春期晚期，女性血清AMH浓度达到高峰，并在整个生育年龄持续存在，但随着年龄的增长，浓度逐渐下降，绝经后又无法检测到[45]，AMH主要由未受FSH刺激的“小卵泡”产生[46]。生殖晚期女性血清AMH浓度与原始卵泡的数量呈显著正相关[47]，但是研究者在生殖早期的小鼠上发现，原始卵泡数量下降而血清AMH浓度却相对稳定[48]，表明血清AMH濃度与原始卵泡数量间的正相关关系可能仅局限于生殖晚期。

在鸡卵泡中，AMH在直径为1 mm的卵泡里表达量最高；在3～5 mm的卵泡里表达量有所降低；在6～8 mm的卵泡里表达量差异不显著，但显著低于前述小卵泡；在9 mm以上的成熟卵泡里几乎无表达[49]。但是在猪卵泡里观测不同大小直径的卵泡AMH浓度后，并未发现显著差异，其原因尚不明了[50]。

3 AMH检测方法

AMH检测技术的发展日新月异，已经从早期的免疫细胞化学分析及放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）到酶联免疫吸附测定技术（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），再到目前的全自动AMH检测技术。

AMH技术最早可追溯到1982年，那时Tran等[51]利用RIA技术检测了AMH在牛塞尔托利氏细胞中的定位，该技术侧重于AMH在动物组织中的定位、功能及含量分析，但无法应用于临床诊断[52]。此后，AMH ELISA检测技术经历了第一代和第二代的发展历程；为满足AMH的临床检测需求，1990年Hudson等[53]率先建立了AMH ELISA检测方法；而后，Immunotech（IOT）与Diagnostic Systems Laboratories（DSL）分别推出了商品化ELISA检测试剂盒，即第一代ELISA检测试剂盒。由于这两种试剂盒的检测标准不一样，因而其检测结果差异较大，而且易受样品储存等因素影响，稳定性较差。为了获得统一的AMH检测标准，Beckman-Coulter（美国贝克曼库尔特有限公司）整合了这两个商品化ELISA检测试剂盒，Ansh Labs先后推出了超灵敏的AMH ELISA检测试剂盒与pico AMH ELISA检测试剂盒，建立了第二代ELISA检测技术[54]，该技术规避了样品及操作者的影响，检测阈值广，灵敏度高，结果可靠，但不同试剂盒各具优缺点[55]。现代AMH检测技术是2014年由罗氏诊断推出的全自动AMH检测技术——Elecsys？誖AMH检测系统，随后，Beckman-Coulter也推出了全自动的AMH检测技术——Access AMH检测系统，采用目前全球最先进的免疫标记分析技术——电化学发光免疫法（Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）[56]检测人血清AMH浓度，其精密度高、准确度好，具有良好的线性测定范围值[57]，为AMH提供了更准确、灵敏、快速、方便的检测方法并应用于临床检验[58]；并且人类医学上的AMH检测技术发展能为畜禽AMH检测技术的研发提供重要借鉴。

4 禽类AMH研究进展

1996年，Eusebe等[59]克隆了鸡的AMH基因，并分析了其基因结构，发现AMH基因的一般结构，认为从转录起始到聚腺苷酸化位点以及蛋白质的主要特征在鸡与哺乳动物之间是保守的。

有关AMH基因在禽类卵泡发育中的功能研究起步相对较晚。2008年，Johnson等[49]首次检测了产蛋鸡不同等级卵泡中颗粒细胞AMH基因的表达情况，发现AMH基因的mRNA表达量随着卵泡的发育逐渐降低，AMH主要由小卵泡的颗粒细胞表达，与哺乳动物的表达模式相一致，表明AMH基因的生物学功能方面具有高度保守性；认为营养因素不能直接影响AMH的表达量，AMH抗体能抑制颗粒细胞增殖，AMH可通过自分泌或旁分泌促进颗粒细胞增殖，过量的AMH会抑制最佳的卵泡选择。

Wojtusik等[60]研究发现，维生素D可能参与母鸡AMH的表达调控，影响卵泡的选择。

Luke等[61]对鸡AMH基因进行了过表达研究，发现AMH基因过表达会破坏性腺性分化，阻断性激素的合成，导致性器官分化不明显，而体重却表现为与遗传性别相匹配。

Shen等[62]采用全基因组关联分析方法（GWAS）筛选了影响鸡卵泡数的候选基因，发现了AMH在鸡卵泡发育中的关键作用，认为AMH是预测小黄卵泡的一个极好的候选基因，AMH基因变异可作为小黄卵泡发育的预后生物标志物。

陈蓉等[63]采用定量PCR技术检测了连城白鸭不同等级卵泡中AMH等基因的表达情况，发现AMH基因的表达量随着卵泡的发育而逐渐降低，认为在鸭等级前卵泡中，AMH基因的高表达量有助于维持颗粒细胞未分化的状态，抑制原始卵泡的初始募集，进而维持卵泡的发育潜能。

可见，禽类AMH激素的基础研究取得了显著进展。AMH作为目前最好的卵巢储备功能标志物质，已在畜牧业中得到了很好应用。薛建华等[64]研究发现，可以通过检测AMH含量，筛选卵巢储备功能好的母牛用于超数排卵，以预测牛胚胎生产潜力，从而选择高产胚胎供体牛提高胚胎生产效率、降低胚胎生产成本。Lahoz等[65]研究了母羊血浆AMH含量，发现97 pg/mL的AMH浓度是一个最佳的分界值，血浆AMH浓度≥97 pg/mL的母羊生产能力比AMH<97 pg/mL的高34.8%，认为依据个体血浆AMH水平来选择有更大生产潜力的母羊留种在生产实践中可能成为一种简便、快捷、低成本的选种方法。但是，AMH在禽类繁殖中的应用研究却鲜见报道，需要迎头赶上。

5 禽类AMH应用前景展望

医学研究表明，AMH 在评价女性卵巢功能方面有着重要的价值，是目前预测卵巢储备功能最好的血清标记物[66]，有望成为准确评价妇女卵巢功能的可靠指标，在临床的应用具有很大的发展空间[67，68]。目前，AMH医学临床检测技术迅猛发展，但国内AMH商品化检测系统发展较为落后，普及率极低，检测价格昂贵，制约了AMH检测技术的应用推广。借鉴国外AMH检测技术的发展及其优势，尝试建立快速、稳定、准确、灵敏的AMH检测系统，降低AMH检测费用，将有助于推动国内AMH的深入研究和检测技术推广[69]。AMH作为评价卵巢储备功能的重要指标，科技工作者对畜禽AMH的研究也取得了重要进展，但在种畜禽生产中还没有被广泛应用。因此，通过深入研究禽类血液AMH与卵巢储备能力之间的关系，探明通过禽类血液AMH水平预测繁殖潜能的方法，研发实用性强、域值广泛、易操作的种禽AMH快速检测技术产品，将有助于实现对高产种禽的早期标记辅助选择，从而选留高繁殖力的种禽，提高种禽养殖效益。可以预见，随着人们对AMH在禽类繁殖领域中的深入研究及其检测技术的创新发展，AMH将在种禽生产应用中发挥出重要作用。

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