钾离子通道在奥沙利铂诱导的周围神经痛中的作用❋

王江栓 李变锋 李 磊 张义丹 曹 靖 程 琦△

(漯河医学高等专科学校, 1 解剖学教研室, 2 第二附属医院, 漯河 462000； 3 郑州大学基础医学院解剖学教研室, 郑州 450001)

奥沙利铂是第3代铂类抗癌药物,是继顺铂、卡铂之后抗癌谱更广、疗效更好、副作用更低,且与顺铂和卡铂之间无明显交叉耐药的铂类抗肿瘤药[1]。但是,随着奥沙利铂在临床日益广泛的应用,其毒副作用,特别是神经毒性的出现,限制了其临床应用[2]。奥沙利铂神经毒性临床表现主要为冷刺激诱发或加剧的肢体末端感觉异常,其发生机制目前仍不明确。研究表明,奥沙利铂诱导的周围神经毒性症状可能是由于奥沙利铂对细胞膜上阳离子通道的影响所致,本研究探索钾通道是否参与奥沙利铂所致疼痛的发生发展,以及利用实验动物尝试促进钾通道表达的药物缓解奥沙利铂化疗痛。

1 材料和方法

1.1 实验动物和模型建立

SPF清洁级、成年雄性SD大鼠(购于河南省实验动物中心),体质量180～220g,大鼠被安放在清洁开放的房间,在12h光照/黑暗的环境中饲养,室温维持在22～25℃,自由进食水,采用双盲法进行相关行为学检测。采用随机方法把36只SD大鼠分成对照组和奥沙利铂组。奥沙利铂注射液购于齐鲁制药(海南)有限公司(产品批号： 2A1E1510017B)；5%葡萄糖注射液购于浙江济民制药有限公司(产品批号： 12050611)；奥沙利铂注射液溶解于5%葡萄糖注射液中,以4.8mg/kg进行腹腔注射,模拟临床给药时间点给药,注射时间分别为第1、2、8、9、15、16、22天共7次。奥沙利铂诱导周围神经病理性疼痛大鼠模型建立成功第15天给予氟吡汀灌胃(5、50mg/kg)。

1.2 行为学检测

机械疼痛测试采用经典的von-Frey纤毛,将纤毛通过金属网眼垂直刺大鼠后足底中心皮肤,用力至弯曲成S形,每次刺激持续3～4s,观察反应,大鼠在刺扎时间内或在移开von、Frey针时出现快速的缩足或舔足反应,记为阳性。

足对有害热退缩潜伏期测定用模型336镇痛仪(美国),大鼠置于有机玻璃室的玻璃板上,辐射热穿过玻璃板照射足底表面的中间。当动物抬脚时,光束断开,每一侧每次试验重复5次,间隔为5min,无论有无阳性为避免组织损伤光束截止时间15s。

足对有害低温退缩潜伏期(0℃)的测定用1个冷板,其被设置在0℃,足放置在平板开始计时,至舔足和退缩终止,定义为冷刺激缩回潜伏期。每个实验重复3次,每次时间间隔为10min。60s为截止时间,避免足底组织损伤。

1.3 获取标本

大鼠建模后在第3天、8天、15天采用10%的水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉,取第4～5腰椎(L4～L5)背根神经节(DRG)用于RT-PCR、免疫印迹、免疫组织化学方法检测。

1.4 RT-PCR

总RNA通过TRIzol法,oligo dT为通用引物,使用Thermo Script逆转录酶,两步法RT。每个样品3个复孔,根据目的基因设计特异性正向和反向引物。反应在BIO-RAD CFX96实时PCR仪器中进行。65℃～95℃溶解曲线,反应完成后,Bio-Rad Prime PCR软件分析荧光信号数据,计算各反应管Ct值。所得数据以GAPDH为内参照,采用2-ΔΔCt方法计算各目的基因的相对表达。

1.5 免疫印迹检测

冰上研磨组织,加入胞质裂解缓冲液,低温离心,上清为胞质蛋白,蛋白质浓度检测；SDS-PAGE电泳(10% SDS分离胶)；免疫反应(兔抗Kv1.2单克隆抗体,购于以色列Alomone Labs公司,按1∶1000稀释；兔抗β-actin单克隆抗体,购于北京中杉生物科技公司,辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗购于美国Jackson公司),曝光(美国Protein Simple FC-M型化学发光成像系统)。

1.6 双标荧光免疫组织化学显色

大鼠麻醉后,4%多聚甲醛灌注。获取DRG后固定并逐步脱水,冷冻切片。0.01mol/L的PBS含有10%血清和0.3%的Triton X-100室温下封闭1h,一抗(兔抗Kv1.2单克隆抗体)4℃过夜,0.01mol/L的PBS洗3遍,二抗(鼠抗CY3单克隆抗体购于美国Jackson公司)室温下1h。使用Leica DMI4000荧光显微镜拍照。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 行为学的变化

奥沙利铂组与对照组在给药前行为学无差异。注射奥沙利铂以后大鼠的机械痛阈值和冷觉痛阈值均开始减低,第8天开始2组大鼠机械痛阈值和冷觉痛阈值均差异均具有统计学意义(P<0.001),一直持续到第22天。而大鼠的热觉痛阈值和体重两者之间无明显差异,提示奥沙利铂的消化道不良反应比较轻微(图1)。

图1 腹腔注射奥沙利铂后,奥沙利(OXA)铂组大鼠的机械阈值(A)

给予氟吡汀灌胃后可以缓解奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛,给予5mg/kg氟吡汀后机械痛阈值较奥沙利铂组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05),而冷觉痛阈值无明显的变化。给予50mg/kg氟吡汀后机械痛阈值和冷觉痛阈值较奥沙利铂组明显增高,差异均具有统计学意义(图2)。

图2 奥沙利铂(OXA)组大鼠灌胃给予5、50mg/kg氟吡汀后,两种剂量

2.2 DRG中Kv1.2的变化

大鼠DRG中Kv1.2的mRNA和蛋白表达在给予奥沙利铂后的第3天无明显的变化,但在第8天和第15天均减低,与对照组比较差异均有统计学意义(图3,P<0.01)。

2.3 大鼠DRG中Kv1.2的分布

在DRG神经元中,Kv1.2与CGRP(伤害性肽能神经元标记物)、NF-200(有髓鞘的非伤害性感觉神经元标记物)、IB4(无髓鞘的伤害性感觉神经元标记物)共标,而与GS(胶质细胞标记物)不共标(图4，见封二)。

3 讨论

奥沙利铂是继顺铂、卡铂之后抗癌谱更广、疗效更好、副作用更低的铂类抗癌药[1-2]。众多的临床研究资料显示,奥沙利铂在在卵巢癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等实体瘤的治疗中都取得较好的治疗效果[3-4],但是其神经毒副作用严重限制了其临床应用,因此探明奥沙利铂的神经毒副作用的机制,找到可行的解决方案,将有可能帮助解决其临床应用的障碍。

奥沙利铂诱导的神经毒性有两种类型,一种是快速的急性感觉神经病变,另一种通常发生几个周期之后,为延迟的累积性的感觉神经病变[5]。其中急性周围神经病变的发生率为86%～95%,以周围神经过度兴奋为特征,临床表现为冷刺激诱发或加剧的肢体末端感觉异常和感觉迟钝,包括下巴痛、眼痛、注射药物一侧肢体痛、上睑下垂、下肢痉挛以及视力和声音改变等症状。这些症状在用药后数小时即可出现,24～48h为高峰期,一般持续7d左右[6]。奥沙利铂所致慢性周围神经病变临床表现为末梢感觉减退或感觉缺失、上下肢麻木等,严重时造成肢体功能障碍[7]。其发生率与剂量相关,具有蓄积性和可逆性。蓄积性一方面表现为慢性神经病变发生率随剂量累积而增加,另一方面表现为相关症状的持续时间和严重程度随剂量累积延长和加重。

图3 在奥沙利铂组大鼠的DRG中8d、15d的Kv1.2

奥沙利铂所致慢性周围神经病变的发生机制目前仍不明确,目前国内外的研究表明,奥沙利铂诱导的周围神经毒性症状是由于奥沙利铂对细胞膜上阳离子通道的影响所致。神经元细胞膜上阳离子通道包括钾通道、钙通道、钠通道等[8-9]。其中钾通道的活性与细胞膜的静息电位密切相关,是神经元兴奋性的重要决定因素[10]。抑制钾通道可导致神经元细胞的异位放电频率增加,从而参与慢性疼痛的发生发展[11]。Li等[12]研究证明损伤DRG后伴随Kv电流减少,说明钾离子通道在DRG损伤引起的疼痛中起到至关重要的作用。有研究[13]表明坐骨神经慢性压榨性损伤(chronic constrictive injury， CCI)模型侧的背根神经节上的Kv通道的α亚基表达较对侧显著降低,提示DRG的Kv电流降低与神经兴奋性升高显著相关。有报道[14]称神经元损伤后钾离子电流的减少,会出现神经兴奋性增高进而导致痛觉过敏。提示神经病理性疼痛的产生可能与神经元细胞上表达的钾离子通道电流降低有密切关系。那么,钾离子通道的变化是否与奥沙利铂化疗痛相关？

研究需要合适的动物模型,本研究通过采用模拟临床药物应用时间点给予大鼠注射药物建立奥沙利铂动物模型。实验结果显示给予奥沙利铂后,大鼠的机械阈值和冷觉阈值均出现明显的降低,说明模型建立成功,而大鼠的体质量无明显的变化,说明奥沙利铂的消化道毒性比较轻微,因此为研究其发生机制提供了较好的动物模型。本实验在奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛大鼠模型中检测到Kv1.2的mRNA和蛋白的表达量均降低,且存在时间依赖性。提示Kv1.2可能参与奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛,为临床上预防和治疗奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛提供新的靶点。实验继续尝试钾离子兴奋药物观察是否缓解奥沙利铂诱导的化疗痛。本实验应用钾离子兴奋剂氟吡汀灌胃治疗,通过灌胃给予大鼠不同剂量的氟吡汀后,模型大鼠机械阈值和冷觉阈值明显增高,并且50mg/kg的效果较5mg/kg的明显,说明氟吡汀缓解奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛呈剂量依赖性,但是最佳剂量需要进一步的实验探索。氟吡汀是一种钾离子通道的兴奋剂,可以降低神经元的兴奋性,稳定膜电位,缓解奥沙利铂导致钾离子通道1.2的表达下降导致的钾通道功能的降低,说明钾离子通道在奥沙利铂诱导周围神经性疼痛中起到重要的作用。

总之,Kv1.2在奥沙利铂诱导的周围神经疼痛的发生、发展中发挥重要的作用,可能为临床上预防和治疗奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛提供新的靶点和新的方向。