东乡族视黄醇结合蛋白4基因位点多态性与2型糖尿病的相关性分析❋

杨雨旸 常 青 高静媛△ 张 放 梁芳倩 刘 静

(华北理工大学, 1 中医学院, 2 附属医院老年病科, 唐山 063000； 3 甘肃省人民医院, 兰州 730000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种受多基因影响的代谢性疾病,其患病率呈逐年上升趋势[1],成为21 世纪威胁人类健康最重要的慢性非传染性疾病之一[2]。在我国,东乡族是甘肃省特有的少数民族,是糖尿病高发民族[3],且保持有纯化程度比较高的遗传特性[4]。视黄醇结合蛋白4(retibol-binding protein 4, RBP4)是糖尿病的独立危险因素,与胰岛素抵抗及胰岛素分泌密切相关,其遗传变异可能是评估2型糖尿病患病风险的重要因素。对于不同的种族,RBP4基因的遗传易感性不同,因此本研究采用聚合酶链式-变性高效液相色谱(polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography, PCR-DHPLC)和DNA测序技术相结合对甘肃省东乡族人群2型糖尿病群体RBP4基因的rs17484721和rs36035572位点多态性进行筛查和测序分析,探讨RBP4基因多态性与东乡族人群2型糖尿病的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

随机选取甘肃省临夏自治州东乡族2型糖尿病患者107例,其中男74例,女33例,平均年龄(53.65±9.73)岁及同期115例健康体检人群,其中男80例,女35例,平均年龄(51.83±9.10)岁。分别设为Ⅱ型糖尿病组和对照组。彼此间无血缘关系。均排除吸烟嗜酒者；排除高血压、冠心病以及肝、肾疾病；排除1型糖尿病、继发性糖尿病等。2型糖尿病诊断按照2005年世界卫生组织规定的诊断标准,空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≧7.0mmol/L和(或)口服葡萄糖耐量(OGTT) 2h血糖≧11.1mmol/L。患者均签署知情同意。

1.2 临床数据及生化指标检测

按照统一标准,采取面对面问卷调查询问,测量受试者身高、体质量(body mass index, BMI)、收缩压(systolic blood pressure, SBP)、舒张压(diastolic blood pressure, DBP)。抽取受试者清晨空腹静脉血10ml,5ml EDTA抗凝用于DNA提取,其余5ml用于检测空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)；空腹血浆胰岛素(fasting plasma insulin, FPI)；胰岛素抵抗指数(insulin resistance index, HOMA-IR)；血清总胆固醇(total cholesterol, TC)；血清甘油三酯(triglyceride, TG)；高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)； 低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)。

1.3 分子生物学检测

1.3.1 基因组DNA提取 取静脉血5ml与EDTA抗凝,SDS-蛋白酶K消化蛋白质及肽类,用苯酚-氯仿法萃取法除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离,提取DNA后,溶于TE缓冲液,置-20℃冰箱保存以备用。

1.3.2 PCR扩增 参照NCBI GenBank中nt_030059序列用Primer 5软件设计RBP4基因第5内含子区PCR扩增特异性引物,正向引物5′-agggtgccttctggctc ttc-3′和反向引物5′-ctttactgggctgctcaatc-3′。PCR条件如下： 95℃预变性1分钟,95℃ 30s下进行30次变性,56℃退火30s,72℃处延长40s,72℃延长10min。然后以0.01℃/s的速度缓慢降至45℃,使之充分形成杂合双链。产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳确认后待检测。

1.3.3 变性高效液相色谱分析 将产物置于WAVE的DNA片段分析系统(Transgenomic公司)的96孔板上,根据解链曲线,利用DHPLC检测仪和WAVE-Maker 4.1软件选出全部扩增片段的最适检测温度(60.5℃)和分离梯度。取6μl PCR扩增产物自动上样至DNA分离柱,用缓冲液A[pH7.0,0.1mmol/L三乙胺乙酸盐(TEAA),0.1mmol/L EDTA]、缓冲液B(pH 7.0,0.1mmol/L TEAA中含25%的乙腈)以0.9ml/min 的流速进行洗脱。被分离柱洗脱的异源双链DNA溶液用吸收峰为OD 260nm波长紫外检测仪检测。

1.3.4 DNA测序 DHPLC检测后再在色谱图中显示为峰的数目和宽度异常的PCR产物在自动ABI 3730遗传基因分析仪上进行核苷酸序列测定(上海生工测序有限公司)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组人群一般情况比较

结果如表1所示,东乡族受试者2型糖尿病组人群WHR、FPG、HOMA-IR、SBP较对照组高,差异有统计学意义(P<0．05)。

表1 东乡族所有受试者的临床数据特征比较

BMI： body mass index; WHR： waist hip ratio; FPG： fasting plasma glucose; FPI： fasting plasma insulin; HOMA-IR： insulin resistance index; SBP： systolic blood pressure; DBP： diastolic blood pressure;*P<0.05vscontrol group

2.2 PCR-DHPLC筛查

DHPLC法分析表明RBP4第5内含子片段中存在两个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)(rs17484721和rs36035572位点),且每个SNP有两个等位基因(分别为rs17484721的T/C等位基因和rs36035572的 I/D等位基因)和3种基因型(rs17484721的TT、TC和CC基因型和 rs36035572的II 、ID和 DD基因型)。2个位点的突变存在强连锁不平衡,并且两者的等位基因频率均小于5%。本实验得出3个色谱(图1)： 147例野生型(图1A),71例为杂合子突变(图1C)和4例纯合突变(图1B)。DNA测序分析表明,这2个单核苷酸多态性的变化总是同时发生的,当rs17484721是T等位基因时,rs36035572会插入I突变基因；当检测rs17484721是C等位基因,在rs36035572会缺失D突变基因。DNA测序分析的结果如图2所示。

图1 DHPLC检测RBP4基因PCR产物的色谱图。A： 无突变患者色谱图；B： 纯合突变携带者色谱图；C： 杂合突变携带者色谱图.

图2 DNA序列分析结果。左边是rs17484721；右边是rs36035572。这2个位点之间的距离68bp。I代表T变异；D表示因rs36035572变异所失去的T。A： 杂合子变异与T/C和I/D序列；B： 没有任何突变的序列；C： 纯合子变异C/C和D/D序列.

Fig 1 Chromaotgraphic WAVE pattern by DHPLC for the RBP4 PCR products. A： DHPLC chromatogram of the carriers without mutation; B： DHPLC chromatogram of the carriers with homozygous mutation; C： DHPLC chromatogram of the carriers with heterozygous mutation.

Fig 2 The result of DNA sequence analysis. On the left is rs17484721; on the right is rs36035572. The distance between the two SNPs is 68bp. I represented the inserted variation of T; D represents T at rs36035572 that was lost due to mutation. A： Heterozygous variant with T/C and I/D; B： Sequence without any mutation; C： Homozygous variant with C/C and D/D.

2.3 等位基因和基因型频率的比较

测试所有受试者基因型的遗传变异,基因型频率分布符合哈迪-温伯格遗传平衡定律(Hardy-Weinberg quilibrium),即： 2型糖尿病PH-W=0.962；对照组PH-W=0.662。显示T和I等位基因频率为82.2%,C和D等位基因频率为17.8%。观察到的2个SNPs的基因型频率的不偏离。2型糖尿病组的TT和Ⅱ 2个基因型的频率较对照组显著增高(P<0.05)；2型糖尿病组的等位基因T等位基因频率较高,C等位基因和D等位基因较对照组降低(P<0.05)。基因型和等位基因频率数据见表2。

*P<0.05vscontrol

2.4 单体型对照分析

由2个SNPs构建的2型糖尿病患者中的单体型基因(T/T-I/I or C/C-D/D)与对照组相比,T/T-I/I单体型较高和C/C-D/D单体型显著降低,即在2型糖尿病患者中,T、I等位基因频率较高,C、D等位基因频率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。评估紧密连锁不平衡(LD)区域,具有较强的成对连锁不平衡(D>0.9,R2>0.9)(表3)。

*P<0.05vscontrol

2.5 基因型临床特征分析

按单体型分组,本次实验检测东乡族所有受试者的临床指标,显示不同的基因型与血清甘油三酯(TG)之间存在关联。在TG水平上,2型糖尿病组中TT+Ⅱ基因型显著高于TC+CC和ID+DD基因型(P<0.05)；对照组中TT+Ⅱ基因型显著高于TC+CC和ID+DD基因型,差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 东乡族不同基因型的临床指标比较

BMI： body mass index; WHR： waist hip ratio; FPG： fasting plasma glucose; FPI： fasting plasma insulin; HOMA-IR： insulin resistance index; SBP： systolic blood pressure; DBP： diastolic blood pressure; TC： totalcholesterol; TG： triglyceride; HDL-C： high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C： low-density lipoprotein cholesterol;*P<0.05vsTT/Ⅱ group

3 讨论

目前,2型糖尿病受到越来越多的关注,它是一种多源性病因所引起的疾病,主要受遗传因素、社会因素、生活方式及环境因素等综合影响,而这些因素是2型糖尿病的高危发病因素[5]。本次研究对象选取基因纯合性较高的东乡族人群,由于东乡族人群的饮食习惯主要是高糖高脂,多以从事体力劳动,对疾病认知不足,地处偏远且经济文化落后,这可能是高发2型糖尿病的主要因素[6]。2型糖尿病其发病机制主要是胰岛素抵抗。RBP4是近几年研究比较热门的易感基因,临床研究表明升高血清中RBP4水平可增加代谢性疾病的发病率,包括肥胖、胰岛素抵抗、心血管疾病、2型糖尿病[7-8]。且流行病学研究表明,人体循环中RBP4水平的升高会标志着这些疾病的发生[9]。有动物实验表明,升高小鼠RBP4基因的mRNA表达水平可发生胰岛素抵抗,而降低RBP4基因mRNA表达水平则提高胰岛素敏感性[10]。RBP4基因非编码区SNP位点可能引起胰岛素抵抗,并参与糖尿病的发生发展[11-12],其原因可能是RBP4通过阻断抗原呈递和T细胞活化从而诱导的胰岛素抵抗[10-13]。本研究选取东乡族人群作为研究对象,DHPLC法分析表明RBP4第5内含子片段中存在两个单核苷酸多态性(SNP)(rs17484721和rs36035572位点),且每个SNP有两个等位基因(分别为rs17484721的T/C等位基因和rs36035572的 I/D等位基因)和3种基因型(rs17484721的TT、TC和CC基因型和 rs36035572的II 、ID和 DD基因型)。DNA测序分析表明,rs17484721和rs36035572处于连锁不平衡(LD)区域,具有较强的成对连锁不平衡。

测试所有受试者基因型的遗传变异,其基因型频率分析结果表明,相比其他位点的基因型,在2型糖尿病组中,rs17484721位点的TT基因型频率明显增高,rs36035572位点的Ⅱ基因型频率也明显增高,说明相对于携带其他基因型的人,携带有TT基因型和(或)Ⅱ基因型的人更易患2型糖尿病；且构建的单体型模型表明,2型糖尿病组中的单体型基因中,T/T-I/I单体型较对照组显著增高；C/C-D/D单体型较对照组显著降低,即在2型糖尿病患者中T、I等位基因频率较高,C、D等位基因频率降低,说明单体型TT-II可能与2型糖尿病具有相关性,并且可能是2型糖尿病的易患多态位点。rs17484721和rs36035572位于RBP-4 基因密集LD 区域,此区域包括RBP4下游基因G 蛋白偶联受体120基因(GPR120)的部分序列。GPR120基因在体内分布广泛[14],分别是通过激活GPR120偶联G蛋白(Gq/11)或β-抑制蛋白这两条途径来促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌、促进GLP-1 释放、抗炎等,目的是改善对2型糖尿病的体内代谢状态[15-16]。因此,可推测rs17484721位点的TT基因型频率和rs36035572位点的Ⅱ基因型频率的增高可能引起了GPR120在mRNA水平上的转录和蛋白水平上的翻译,进一步说明,基因型频率的变异可能与2型糖尿病的发病率有相关性。

膜葡萄糖转运蛋白一方面是胰岛素敏感的靶组织的主要胞膜转运蛋白,另一方面有助于细胞对葡萄糖的吸收[17]。它的缺陷是胰岛素抵抗的一个早期特征[18]。研究表明[20]RBP 4血清水平的升高能够通过抑制肌肉中的胰岛素信号通路和增加肝糖输出而增加胰岛素抵抗,并且RBP4-GLUT4系统可改善2型糖尿病症状。有研究采用logistic回归和Cox回归分析确定视黄醇暴露水平对2型糖尿病风险的影响[20-21]。说明RBP4-GLUT4系统与2型糖尿病存在一定的关联性。

本研究分析了脂代谢紊乱与2型糖尿病的基因易感性之间的关系,显示在TG水平上,2型糖尿病组和对照组中TT+II基因型显著高于TC+CC和ID+DD基因型,因此表明,TG水平的高低与东乡族2型糖尿病的rs17484721和rs36035572多态性具有相关性。本研究还显示两组TT-II基因型的HOMA-IR水平差异无统计学意义,因此可以增大样本量,减小误差,进行深层次的研究和证实。

总之, RBP4基因变异可能与东乡族人2型糖尿病和血清甘油三酯水平有关。rs17484721和rs36035572基因多态性参与东乡族2型糖尿病的发病风险,它们的变化与东乡族人群血清甘油三酯水平相关。本次研究由于东乡族总人口数较少,样本量相对较少,及因2型糖尿病是多基因遗传性疾病,而且每个易感基因功能不同且作用微效,因此应该进行多基因综合检测,以后应在这两方面进行深入研究。