槲皮素对细菌脂多糖诱导流产小鼠子宫蜕膜巨噬细胞功能的影响❋

卢 浩 吴雷振 张瑞平 张玉玲 钱志英 张顺利

(河南师范大学生命科学学院, 省部共建细胞分化调控国家重点实验室, 新乡 453007)

免疫抑制剂的研究一直是医学研究的热点。槲皮素(quercetin)属黄酮类化合物,具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒及免疫调节等作用[1-2]。近期研究显示槲皮素在对抗细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)致流产过程中具有独特功效。当细菌侵入受孕机体后,其表面LPS可与巨噬细胞CD14相结合,进而激活巨噬细胞分泌炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α),并伴随着子宫巨噬细胞大量迁移至内膜,形成不利于胚胎发育的环境[3]。槲皮素可抑制LPS诱导的巨噬细胞功能活性,减少其TNF-α和NO(nitric oxide, NO)产生[4],下调LPS所诱导细胞的单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)分泌量[5]。本课题组前期研究证明,中药水红花子对LPS 诱导流产小鼠子宫巨噬细胞具有抑制效应及保胎作用[6],而槲皮素是水红花子的主要成分之一。为此,本研究旨在探讨槲皮素对小鼠的抗流产效应和免疫抑制作用的分子机制,为中药免疫抑制剂的开发和临床应用提供理论与实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与器材

槲皮素(南京泽朗医药有限公司)；蛋白酶抑制剂(PMSF),LPS(美国Sigma公司)；兔抗鼠CD14抗体,SABC(兔IgG)试剂盒,小鼠MCP-1 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；DAB酶底物显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；小鼠TNF-α ELISA试剂盒(美国R&D公司)等。

1.2 实验动物分组及模型建立

昆明种6～8周龄未经产雌鼠200只与雄鼠30只,体质量25g(购自新乡医学院动物饲养中心),常规饲养,自由饮水,制作小鼠阴道涂片进行动情期鉴定。而后将动情期雌鼠与雄鼠2∶1合笼过夜,次日清晨阴道口检出阴栓者定为孕0天(D0)。而后将孕鼠随机分为对照组和实验组,对照组为PBS处理组,实验组分别为LPS流产模型组、槲皮素处理组、槲皮素+LPS处理组。各组分别于末次注射后1、3、6、12、24h时取其子宫,观察子宫与胚胎状况,每组每时间点取10只。小鼠左侧子宫角用做免疫组织化学,右侧用做ELISA检验。其具体处理方式如表1。

表1 各组小鼠处理方法

1.3 流产率和胚胎吸收率检测

剖腹取小鼠子宫并观察其胚胎状况,记录流产小鼠数量和胚胎吸收数,并计算胚胎吸收率[胚胎吸收率=被胚胎吸收数/(被胚胎吸收数+未被胚胎吸收数)×100%]和流产率(流产率=流产小鼠数/妊娠小鼠数×100%)。

1.4 免疫组织化学显色

将石蜡切片(6μm)于烘箱烘烤60min；经常规脱蜡复水后,置于0.3% H2O220min封闭内源性过氧化物酶,经抗原修复后用10%正常山羊血清封闭非特异性染色。而后分别滴加1∶100兔抗鼠CD14抗体,于37℃孵育40min后,依次滴加1∶200稀释的生物素标记羊抗兔IgG和1∶200辣根过氧化酶标记链酶卵白素,均于37℃孵育40min；DAB显色,镜检,照相。

1.5 子宫组织匀浆液制备和ELISA测定TNF-α、MCP-1含量

将小鼠子宫置于预冷PBS中剪除多余脂肪,剖开子宫,剥离胚胎。在含0.75μg/ml PMSF的PBS中冰浴匀浆,12000r/min、4℃离心15min,取上清液分装,-80℃冻存。严格按照ELISA试剂盒说明书进行TNF-α、MCP-1检测,反应后即刻在酶标仪450nm处读取OD值,由标准曲线分别计算出各组样品中TNF-α、MCP-1含量(pg/ml)。

1.6 细胞计数和统计学处理

2 结果

2.1 槲皮素对小鼠胚胎发育的影响

对照组和槲皮素组无流产现象,胚胎正常,轮廓清晰,呈暗红色,且无出血、淤血现象。模型组全部发生流产,剖检发现其胚胎死亡率为100%,胎盘结构亦严重破坏。槲皮素+LPS组也有流产现象,但与模型组相比,流产率与胚胎吸收率显著降低(P<0.01)(表2)。

2.2 槲皮素对小鼠子宫巨噬细胞的影响

槲皮素+LPS组小鼠子宫组织CD14+巨噬细胞数量与对照组相比,除24h外,各时间点差异均存在统计学意义,且自6h开始显著降低,肌层组织CD14+巨噬细胞数量在24h时恢复至对照组水平；与模型组相比,总体数量明显减少(P<0.01)(图1)。

表2 各组小鼠胚胎发育结果(%)

Note：**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel

图1 槲皮素对小鼠子宫内膜(A)、肌层(B)和外膜(C)

2.3 槲皮素对小鼠子宫CD14蛋白表达的影响

槲皮素+LPS组小鼠子宫组织CD14蛋白量与对照组相比,除肌层组织自6h后无差异外,其余各组织各时间点均显著升高(P<0.01)；与模型组相比,总体含量明显减少(P<0.01)(图3)。

2.4 槲皮素对小鼠子宫TNF-α、MCP-1含量的影响

槲皮素+LPS组小鼠子宫组织TNF-α、MCP-1含量与对照组相比,各时间点均显著升高(P<0.01),但自6h开始明显降低,却仍存在差异；与模型组相比,总体含量明显减少(P<0.01)(图4)。

3 讨论

妊娠是一个各系统相互协调非常复杂的生理过程,母-胎界面正常免疫耐受的维持是妊娠成功与否的关键[7]。当LPS进入孕鼠体内后,通过与CD14、Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)等受体结合[8],激活分布在内膜基底层与功能层的巨噬细胞,促进IL-2、TNF-α、MCP-1等多种细胞因子的分泌,募集巨噬细胞到达此部位发生作用,导致子宫局部免疫微环境的失衡,不利于胚胎发育。槲皮素在对抗LPS致流产过程中具有独特功效,为进一步研究其抗流产效应及其免疫抑制作用机制,本实验采用LPS和槲皮素对孕鼠进行处理,观察其胚胎发育情况,研究结果显示,对照组和槲皮素组无流产现象,而模型组小鼠流产率与胚胎死亡率均高达100%；槲皮素+LPS组流产率和胚胎吸收率虽高于正常对照组,但却显著低于模型组。有研究证实,LPS可诱导小鼠子宫吸收胚胎,而槲皮素可抑制子宫收缩,利于胚胎着床和发育,降低小鼠子宫对胚胎的吸收[9-10]。此均表明LPS可有效诱发小鼠流产,而槲皮素可以对抗LPS引发的小鼠流产。

图2 3h小鼠子宫CD14+巨噬细胞免疫组织化学显色,×200

有研究证明LPS可通过LPS-LBP-CD14-TLR4途径激活巨噬细胞,诱发流产,但是LPS不能穿越胎盘进入胚胎,也不直接影响孕鼠的内分泌功能[11],提示LPS所激活的巨噬细胞的变化是导致小鼠流产的关键,CD14可特异性标记子宫巨噬细胞[12],故本实验系统检测了CD14+巨噬细胞在小鼠子宫各组织的数量、迁移分布和功能活性变化,以及CD14蛋白的表达与子宫TNF-α、MCP-1的含量变化,分析其各项指标与胚胎丢失之间的关系。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠各时间点各层组织CD14+巨噬细胞数量和CD14表达量均显著增多,提示LPS可能通过激活巨噬细胞,上调CD14表达量,继而诱发流产。而槲皮素+LPS组小鼠蜕膜组织CD14+巨噬细胞数量和CD14表达量相比对照组均显著增多,相比与模型组,却均显著减少。表明槲皮素可有效对抗LPS所诱导的CD14+巨噬细胞向子宫内膜迁移和聚集,降低CD14表达量,抑制其功能活性,推测槲皮素可能是通过阻断LPS-LBP-CD14-TLR4途径,抑制巨噬细胞的激活,以达到抗流产作用。LPS诱导流产的一个重要机制是诱导巨噬细胞产生TNF-α,LPS既能使经γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)预致敏的巨噬细胞产生TNF-α,又可直接刺激小鼠脾细胞释放IFN-γ,进而刺激活化巨噬细胞释放TNF-α[13]。与之相对应的是,模型组小鼠子宫各时间点TNF-α的含量均显著高于其余各组,MCP-1的含量亦显著高于其余各组。有文献报道,LPS可致使机体辅助型T淋巴细胞(T helper cell, Th)免疫平衡偏向不利于妊娠的Th1方向,炎症反应增强；槲皮素可使机体免疫平衡朝Th2方向偏移,抑制细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和 巨噬细胞炎症蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)的表达,有利于妊娠的发生,达到保胎效果[14]。本研究经过槲皮素处理之后的槲皮素+LPS组小鼠各时间点TNF-α、MCP-1含量虽高于对照组,但却显著低于模型组。表明槲皮素能下调LPS所诱导细胞MCP-1的分泌,继而发挥免疫抑制效应,而巨噬细胞的迁移分布受MCP-1的调节,TNF-α可刺激炎症细胞产生多种炎症介质如MCP-1和ICAM-1, MCP-1可趋化巨噬细胞在内膜和外膜之间的迁移[15],与本研究结果一致。

图3 槲皮素对小鼠子宫CD14蛋白表达的影响

图4 槲皮素对小鼠子宫TNF-α (A)、MCP-1 (B)含量的影响

本研究通过研究槲皮素对LPS诱发流产小鼠子宫中巨噬细胞表型、分布、活性及功能的影响,揭示了趋化孕鼠子宫内膜和蜕膜巨噬细胞迁移分布的调节因素,从分子水平上阐明了槲皮素的抗流产效应和免疫抑制作用机制,为中药免疫抑制剂的研制和抗感染性因素导致的流产的中药活性成分筛选提供了新的理论和实验依据。