以“甘润濡养”立法的启膈方抑制裸鼠食管癌肺转移的研究

史会娟 ，薛健雄 ，石冬璇 ，孔令玉 ，李晶 *

食管癌发病有明显的地域性差别，我国食管癌的发病率是世界平均发病率的2倍［1］。河北省磁县、涉县食管癌发病率和病死率均高居世界榜首［2］。而转移是导致食管癌患者死亡的主要原因。即使行食管癌根治术的患者约50%在术后2～3年仍会发生局部复发或远处器官转移［3］。我国食管癌患者的5年生存率仅为20.9%［4］。因此，寻求抑制食管癌转移的有效方法是目前的重要课题。

本课题组长期从事食管癌防治研究，提出食管癌（噎膈）的核心病机是“血液衰耗，胃脘干槁”［5］。瘀血、痰阻、逆气只是其不同阶段派生的不同表现，而非噎膈之本质。尤其对于食管癌切除术后患者，只有彻底改变“血液衰耗，胃脘干槁”的状态，应用“甘润濡养”之法，从食管癌的本质着手，才能彻底抑制食管癌转移。本研究旨在探讨以“甘润濡养”立法的启膈方对尾静脉注射食管癌细胞裸鼠肺转移的影响，并探讨其作用机制，以期为以“甘润濡养”立法抑制食管癌肺转移提供更多基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及实验动物 稳转Luciferase荧光素酶基因的人源性食管癌细胞株KYSE-150-Luc和荧光素酶底物购于上海科远迪生物科技有限公司；BABL/c裸鼠共21只，5周龄，体质量18～20 g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0011 NO.11400700208569，饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心（SPF级）。

1.1.2 主要仪器及试剂 动物活体成像系统（NightOWL）购于德国Berthold公司；RPMI 1640培养基购于美国GIBCO公司；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶购于美国GIBCO公司；二甲基亚砜（DMSO）购于北京索莱宝科技有限公司；启膈方药物购自河北省石家庄市乐仁堂总店，由石家庄以岭药业制成水提冻干粉保存；卡培他滨片（希罗达，0.5 g×12片）产自上海罗氏制药有限公司，产品批号SH2085。

1.2 实验方法 本研究时间为2017年2—10月。

1.2.1 药物制备 启膈方提取物（QGF）制备：郁金25 g，沙参25 g，丹参15 g，浮小麦5 g，浙贝10 g，茯苓10 g，砂仁10 g，荷叶5 g，清夏10 g，天冬25 g，山药25 g，为70 kg左右成人每人每日用量，采用水提法制备提取物冻干粉，约30 g。将冻干粉分装并储存于-80 ℃冰箱，应用时用完全培养基配制、倍比稀释，并用滤器过滤。按照公式：小鼠给药剂量（mg/kg）=9.1×人（70 kg）给药剂量。

1.2.2 细胞培养 低分化食管癌细胞株KYSE-150-Luc培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在CO2培养箱内（37 ℃、5% CO2、饱和湿度）连续培养。于倒置显微镜下观察，待细胞贴壁生长至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化并传代。每2～3 d换液1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3 建立裸鼠食管癌肺转移模型 取对数生长期的稳转Luciferase荧光素酶标记的低分化食管癌细胞株KYSE-150-Luc细胞消化，1 000 r/min离心5 min（离心半径6 cm），制成单细胞悬液，用无血清培养基调整细胞浓度为5×106/ml，用1 ml注射器接种于BABL/c裸鼠尾静脉，每只100 μl，共接种21只。

1.2.4 分组及用药情况 将接种癌细胞的裸鼠随机分为对照组（7只）、卡培他滨组（7只）和启膈方组（7只）。接种后第3天，对照组给予0.9%氯化钠溶液灌胃0.2 ml/d，卡培他滨组给予卡培他滨溶液（浓度400 mg/kg）灌胃0.2 ml/d，启膈方组给予QGF溶液（浓度3 913 mg/kg）灌胃0.2 ml/d。其中卡培他滨组每灌胃2周停药1周。3组均灌胃给药12周，而后正常饮水、饮食。

1.2.5 动物活体成像系统观测裸鼠肺转移情况 接种后第4周应用动物活体成像系统观察裸鼠体内转移瘤情况，使用WinLight 32软件评估信号强度。观测前每只裸鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（剂量为35 mg/kg），待裸鼠完全麻痹后（3～5 min）按150 mg/kg腹腔注射0.2 ml由PBS稀释的荧光素酶底物，10 min后通过动物活体成像系统观察体内转移瘤情况。之后每2周用动物活体成像系统观察裸鼠转移瘤情况。接种后第16周统一脱颈处死裸鼠，取肺组织，观察各组肺转移结节大小数目，记录裸鼠体质量。

1.2.6 Western blotting法检测肺转移结节组织中E钙黏蛋白（E-cad）、角蛋白（KRT）8、snail、间隙连接蛋白（Connexin）43、WNT2表达水平 接种后第16周统一脱颈处死裸鼠，取肺转移结节组织，每组标本取0.5 cm3小块置于-80 ℃冰箱中备用；其余肺转移结节组织置于10%福尔马林中固定24 h，常规石蜡包埋，预备HE染色用。

将剪刀、镊子等高压灭菌后，用剪刀将组织切成绿豆大小的碎块，后置于组织研磨器中，加入300 μl的蛋白裂解液和2 μl的苯甲基磺酰氟（PMSF），置于冰上充分研磨，并做标记。将研磨后的组织放入1.5 ml的EP管中，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min（离心半径6 cm），提取上清液至另一EP管中，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作步骤进行蛋白定量检测。将Cx32与5×上样缓冲液混合均匀，100 ℃沸水浴加热5 min使蛋白变性，冷却后，-80 ℃保存备用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜、封固，一抗结合过夜，洗膜，二抗（Donkey Anti-Rabbit IgG H&L preadsorbed）结合。TTBS室温洗膜3次，10 min/次，采用成像分析软件对Western blotting显色区带的信号强度进行相对定量分析，扫描结果用灰度值表示。实验独立重复3次。

1.2.7 各组裸鼠肺转移结节组织HE染色形态学观察 取石蜡包埋肺转移结节组织，将蜡块切成4 μm的切片后常规脱蜡。使用苏木素染色3 min，自来水冲洗2 min。过1%盐酸酒精20 s后取出，自来水冲洗2 min，氨水返蓝20 s，自来水冲洗2 min。伊红溶液染色2 min，后依次进入70%酒精、80%酒精、95%酒精各5 min，无水乙醇10 min。晾干，中性树胶封固。显微镜下观察HE染色结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LDS-t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组裸鼠死亡情况 第16周末共16只裸鼠存活，5只死亡（其中对照组第73天死1只，第107天死1只；卡培他滨组第84天死1只，第109天死1只，第111天死1只）。

2.2 动物活体成像系统观察结果 接种后第12周在肺部区域检测到肿瘤细胞的生物发光信号，提示出现肺转移。其中启膈方组和卡培他滨组光子强度均低于对照组（见图1）。

2.3 3组体质量与初始体质量百分比比较 3组第4、8、12、16周体质量与初始体质量百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组、启膈方组第4、8、12、16周体质量与初始体质量百分比大于卡培他滨组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组第4、8、12、16周体质量与初始体质量百分比小于启膈方组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.4 3组肺转移结节数比较 3组肺转移结节数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组肺转移结节数多于启膈方组、卡培他滨组，差异有统计学意义（P＜0.05）；启膈方组和卡培他滨组肺转移结节数比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

2.5 3组 肺 转 移 结 节 组 织 中 E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表 达 水 平 比 较 3组 E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。启膈方组及卡培他滨组E-cad、KRT8、Connexin43表达水平高于对照组，snail、WNT2表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；卡培他滨组E-cad、KRT8、Connexin43表达水平低于启膈方组，snail、WNT2表达水平高于启膈方组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3、图2）。

表1 3组裸鼠体质量与初始体质量百分比比较（x±s，%）Table 1 Ratios of baseline weight to the weight at the end of 4，8，12，16 weeks of intervention in 3 groups of nude mice

图1 动物活体成像系统观察裸鼠肺转移情况Figure 1 Lung metastasis from esophageal cancer in nude mice observed by using in vivo small animal imaging

表2 3组裸鼠肺转移结节数比较（x±s，个）Table 2 Compare the number of lung metastatic nodules between 3 groups of nude mice

2.6 形态学 肺转移结节组织经HE染色后镜下观察（×200）发现，3组裸鼠肿瘤组织均呈巢状生长，肿瘤细胞排列密集，异质性明显。3组均未见明显肿瘤细胞坏死征象，结合活体成像及肺组织表面结节数结果考虑，启膈方组及卡培他滨组均抑制了食管癌细胞肺转移的发生，但在促进食管癌肿瘤细胞凋亡上效果并不明显（见图3）。

图2 Western blotting法检测3组裸鼠肺转移结节组织E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT 表达水平Figure 2 Western blotting results of the expression levels of E-cad，kRT8，snail，Connexin43 and WNT in lung metastases of 3 groups of nude mice

3 讨论

食管癌根据其临床表现，归属于中医学的“噎膈”范畴。《内经》云“三阳结，谓之膈。饮食不下，膈噎不通，食则吐。”临床中可观察到食管癌患者常表现为大便干结、口苦咽干等胃阴衰耗征象。因此，本研究组提出食管癌的核心病机为“血液衰耗，胃脘干槁”。只有针对这一核心病机“甘润濡养”，才能彻底改变患者的“干槁”状态，防止转移发生。启膈方是由清代程钟龄《医学心悟》中的启膈散化裁而成，以“甘润濡养”立法。前期研究发现其能够稳定病灶、提高生存质量、延长生存期［6］；初步研究发现启膈方可明显增强食管癌细胞间隙连接［7］，增强食管癌细胞间同质黏附［8］，抑制食管癌细胞微丝骨架重构［9］，从而降低食管癌细胞的侵袭能力及迁移能力［7-9］。

上皮细胞间质化（EMT）是肿瘤细胞发生转移的关键过程［10-11］。上皮细胞通过间质化改变使细胞同质黏附减弱、细胞骨架重构，从而获得更强的迁移能力。Snail是锌指转录的snail超家族的成员，是EMT的调控因子之一，具有促进细胞迁移的能力［12-13］；KRT8作为细胞骨架中间丝蛋白最大的亚型，对维持上皮细胞的稳态具有重要意义，并具有调节癌细胞信号传导的功能［14］；E-cad能维持细胞间黏附的稳定和上皮细胞的极性，抑制肿瘤的侵袭转移，E-cad功能丧失可促进EMT；Connexin被认为是一类肿瘤抑制基因。有研究证实食管癌细胞转移常伴有Connexin的异常定位和表达［7，15-16］。

本研究通过建立裸鼠食管癌肺转移模型，发现应用启膈方后肺转移结节数量低于对照组，说明启膈方具有抑制食管癌肺转移的作用。Western blotting结果显示启膈方能够升高食管癌细胞中细胞骨架蛋白KRT8、Connexin43表达水平，降低EMT相关蛋白E-cad、snail、WNT2表达水平，说明启膈方通过增强细胞连接的稳定性，抑制细胞骨架重构，从而抑制EMT来进一步抑制肿瘤转移。但HE染色发现肿瘤组织并未出现明显的坏死征象，提示启膈方可能并不是通过细胞毒性作用来抑制食管癌细胞的侵袭转移。

图3 裸鼠肺转移组织形态学（HE染色，×200）Figure 3 Microscopic examination of lung metastases

表3 3组裸鼠肺转移结节组织E-cad、KRT8、snail、Connexin43、WNT2表达水平比较（x ±s，灰度值/内参灰度值）Table 3 Expression levels of E-cad，KRT8，snail，Connexin43 and WNT2 in lung metastases of 3 groups of nude mice

综上所述，启膈方能够抑制食管癌肺转移，可能与其增强裸鼠间隙连接、抑制EMT有关，且启膈方在控制裸鼠体质量减轻上效果明显优于卡培他滨。